[發明專利]一種利用重組基因工程菌獲得鏈霉菌胰蛋白酶酶原的方法

無效

• 申請號: 201210274589.5
• 申請日: 2012-08-03
• 公開（公告）號: CN102851269A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 陳堅;令楨明;堵國成;康振;李江華
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76;C12N15/57;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一種利用重組基因工程菌獲得鏈霉菌胰蛋白酶酶原的方法與應用，特別是一種高產胰蛋白酶酶原的基因工程菌及構建方法與應用，屬于生物技術領域。

背景技術

鏈霉菌胰蛋白酶(SGT)（E.C.3.4.21.4）是一種來源于灰色鏈霉菌的堿性絲氨酸蛋白酶，其在氨基酸編碼基因結構上屬于pre-pro-protease類型，而通過對灰色鏈霉菌的基因組測序發現編碼SGT的基因SprT中，除去SGT自身信號肽和鏈霉菌活性胰蛋白酶，在其成熟酶N端還具有一段前導肽(-Ala-Pro-Asn-Pro-)（圖1）；通過前人對鏈霉菌胰蛋白酶在灰色鏈霉菌中的分泌，純化，氨基酸測序以及相關生理生化功能的研究，發現在鏈霉菌氣生菌絲和營養菌絲分化時，鏈霉菌胞外開始出現活性胰蛋白酶，純化和氨基酸測序也僅能獲得活性的胰蛋白酶的信息，而帶有前導肽的鏈霉菌胰蛋白酶酶原的活化和活化機理卻未有見到報道，并且對于鏈霉菌胰蛋白酶酶原的獲得也未有報道，因此建立獲得在N端具有野生前導肽的胰蛋白酶酶原的方法，對于鏈霉菌胰蛋白酶酶原晶體結構的研究，以及其激活機理的研究具有至關重要的意義。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種產胰蛋白酶酶原（trypsinogen）的基因工程菌，其特征在于染色體上攜帶有胰蛋白酶酶原（trypsinogen）基因（pmt）。

所述胰蛋白酶酶原（trypsinogen）的基因序列為SEQ?ID?NO:1。

本發明要解決的另一個技術問題是提供一種胰蛋白酶酶原基因工程菌的構建方法。

為解決上述技術問題，所采用的技術方案包括如下具體步驟，見圖1：

第一步鏈霉菌胰蛋白酶酶原基因的獲得及分析

首先，合成灰色鏈霉菌（Streptomyces?griseus）胰蛋白酶基因其次，畢赤酵母（Pichia?pastoris）的表達系統有著特殊的密碼子偏好性，如果不對類胰蛋白酶基因要表達的密碼子的進行一定的分析，畢赤酵母（Pichia?pastoris）可能無法正確翻譯類胰蛋白酶基因。通過胰蛋白酶酶原基因在畢赤酵母中進行表達的密碼子適用指數（CAI）分析，發現在胰蛋白酶酶原基因中并無畢赤酵母無法識別及利用的稀有密碼子，其次，在類胰蛋白酶基因上下游分別加入EcoRI限制性內切酶位點和NotI限制性內切酶位點，進行體外擴增類胰蛋白酶基因，所得基因其核苷酸序列為：SEQ?ID?NO:1；

第二步鏈霉菌胰蛋白酶酶原重組質粒的構建

為了使pmt基因能在酵母中的可控高效表達，選用帶有醇氧化酶基因(AOX)的啟動子AOXI的畢赤酵母表達載體(例如pPIC9K，美國Invitrogen公司)，利用pmt基因序列5′端的EcoRⅠ限制性內切酶位點與3′端的NotⅠ限制性內切酶位點，將pmt基因克隆入載體pPIC9K。由于在AOXI強啟動子后面有一段α-因子信號肽序列，這也為類胰蛋白酶在酵母中的正確分泌表達奠定了基礎；另外，由于pPIC9K載體中含有卡那霉素、氨芐青霉素抗性基因，在篩選重組菌時較為方便。

將含有pmt基因的載體與要連接的表達載體pPIC9K進行EcoRI和NotI酶切，連接得到含有pmt基因的重組質粒pPIC9K-pmt。

第三步鏈霉菌胰蛋白酶酶原基因工程菌的構建

將重組質粒pPIC9K-pmt電擊轉化宿主畢赤酵母GS115，構建高效表達胰蛋白酶酶原的組成型畢赤酵母重組菌株。

本步驟采用的含胰蛋白酶酶原基因的重組表達質粒pPIC9K-pmt可轉化畢赤酵母（Pichia?pastoris），成為能分泌表達外源類胰蛋白酶的功能酵母菌：由于含外源基因的重組表達質粒pPIC9K-pmt上有畢赤酵母AOX基因的部分序列，當重組表達質粒進入酵母細胞后，通過體內同源重組，pPIC9K-pmt可以定向整合到畢赤酵母染色體DNA上。在外源誘導物甲醇存在的情況下，AOXI啟動子啟動外源pmt基因，信號肽指導表達產物進入畢赤酵母的分泌途徑，正確切割成具有生物活性的外源蛋白表達產物，最終將產物分泌至胞外。