[發明專利]水牛乳及其乳制品中奶牛乳源摻入的雙重聚合酶鏈式反應檢測方法

無效

• 申請號: 201210274332.X
• 申請日: 2012-08-03
• 公開（公告）號: CN102808025A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發明（設計）人: 林波;曾慶坤;楊炳壯;李玲;唐艷;農皓如
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區水牛研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 黃永校

技術領域

本發明涉及一種檢測水牛乳及其乳制品中摻入普通奶牛乳的PCR方法，

背景技術

目前我國市場上銷售的水牛乳及其乳制品品質良莠不齊，存在較多的以普通奶牛乳冒充水牛乳的現象，如近日意大利名牌產品莫扎里拉水牛奶酪曝出有四分之一并非純正水牛奶制作，國內部分水牛乳生產企業被曝水牛乳產品銷量與其實際原料乳產量不符，以上這些都影響了我國水牛乳市場的穩定發展。意大利等國家已經建立關于水牛乳及其乳制品中普通奶牛乳摻入的標準檢測方法，對保護其特色的水牛乳產品起到重要作用。現已報道的關于水牛乳及其乳制品中摻入普通奶牛乳的檢測技術包括電泳、免疫學技術、色譜和質譜等，這些技術均是以品種間乳蛋白或脂肪酸組成的差異為判別點。傳統的免疫學方法和電泳技術主要以蛋白質為鑒別對象，因此這兩種方法對加熱處理后的牛奶和乳制品中敏感度大幅降低，且無法對添加了多種未知外源蛋白添加劑的乳制品開展檢測。

相對而言，基于DNA的PCR檢測技術由于極高的靈敏性和可重復性，逐漸代替蛋白分析方法成為主流的檢測技術。其機理是奶牛泌乳過程中，部分體細胞（10⁴到l0⁷/ml）脫落進入牛奶中，而這些體細胞中包含的基因組DNA是區分乳源的有效信息。DNA在高溫下可保持穩定，僅需要少量樣品就可以獲得足夠分析的DNA是PCR法的獨到優勢。因此，采用PCR法不僅可以檢測新鮮水牛乳，而且可以檢測經過加工處理后的所含體細胞DNA較少的水牛乳制品，如高溫滅菌乳、酸奶和奶酪等。現已報道的PCR法需要分兩步對水牛和奶牛特異性基因進行PCR擴增方能進行判別。

發明內容

針對上述問題，本發明的目的是提供一種檢測水牛乳及其乳制中摻入牛屬乳源的PCR方法，該檢測方法具有快速、準確、靈敏的特點，一次PCR擴增就可完成檢測。

為實現上述目的，本發明采取以下技術方案：一種水牛乳及其乳制品中奶牛乳源摻入的雙重聚合酶鏈式反應檢測方法，包括對水牛乳基因組DNA待測樣品的PCR擴增和對PCR產物進行電泳分析，采用3條引物C1、B1和B2組成2對PCR反應，該PCR體系的引物設計方案為：引物C1和B1組成一對擴增水牛特異性基因片段的引物，擴增產物是水牛特異性基因片段；引物C1和B2成一對擴增奶牛特異性基因片段的引物，擴增產物是奶牛特異性基因片段，

所述3條引物序列為：

C1:5’-CTA?GAGGAGCCT?GTTCTATAATCGATAA-3’

B1:5’-AAATAGGGTTAGATGCACTGAATCCAT-3’

B2:5’-TTCATAATAACTTTCGTGTTGGGTGT-3’。

所述的水牛乳及其乳制品中奶牛乳源摻入的雙重聚合酶鏈式反應檢測方法，該方法的檢測步驟如下：

（1）水牛乳基因組DNA待測樣品的PCR擴增

（1.1）在滅菌的eppendorf管中，分別加入：濃度為10μmol/μL的2個引物B1和B2貯存液各0.5μL，1μL濃度為10μmol/μL的引物C1貯存液；2μL濃度為10mM的dNTP貯存液；25μL的2×PCR?Reaction?Mix，內含200mM?Tris?HCl?pH?8.3，500mM?KCl，40mM?MgCl₂，2ug/mlBSA，1.5M?Sorbitol，0.1％?TritonX-100；0.5μL酶活為5u/μL的Taq酶；加入2μL待測牛奶基因組DNA樣品，最后用ddH₂O補齊成總體積50μL的二重PCR反應體系；

(1.2)短暫離心后進行PCR擴增，PCR反應程序為：94℃預變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環；72℃后延伸10min；PCR反應和結束后于4℃保存。

（2）電泳分析PCR產物

配制2％的瓊脂糖凝膠，調整電泳儀至70V電泳約45min，置于凝膠成像分析系統觀測結果，如電泳產物只出現預期長度為220bp的水牛特異性基因片段，則為純水牛乳或制品；如只出現預期長度為346bp的牛屬特異性基因片段，則為假冒水乳或制品；如同時出現220bp的水牛和346bp的牛屬特異性基因片段，則為摻假水牛乳或制品。

所述水牛乳及其乳制品中奶牛乳源摻入是指往水牛乳及其乳制品中摻入其它牛乳，如摻入荷斯坦牛乳，娟姍牛乳等，本發明目的就是提供一種檢測是否摻入其它牛乳的方法。

本發明由于采取以上技術方案，其具有以下優點：