[發明專利]水牛乳及其乳制品中奶牛乳源摻入的雙重聚合酶鏈式反應檢測方法

無效

• 申請號: 201210274332.X
• 申請日: 2012-08-03
• 公開（公告）號: CN102808025A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發明（設計）人: 林波;曾慶坤;楊炳壯;李玲;唐艷;農皓如
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區水牛研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 黃永校

1.一種水牛乳及其乳制品中奶牛乳源摻入的雙重聚合酶鏈式反應檢測方法，包括對水牛乳基因組DNA待測樣品的PCR擴增和對PCR產物進行電泳分析，其特征是，采用3條引物C1、B1和B2組成2對PCR反應，該PCR體系的引物設計方案為：引物C1和B1組成一對擴增水牛特異性基因片段的引物，擴增產物是水牛特異性基因片段；引物C1和B2成一對擴增奶牛特異性基因片段的引物，擴增產物是奶牛特異性基因片段，

所述3條引物序列為：

C1:5’-CTA?GAGGAGCCT?GTTCTATAATCGATAA-3’

B1:5’-AAATAGGGTTAGATGCACTGAATCCAT-3’

B2:5’-TTCATAATAACTTTCGTGTTGGGTGT-3’。

2.根據權利要求1所述的水牛乳及其乳制品中奶牛乳源摻入的雙重聚合酶鏈式反應檢測方法，其特征在于，該方法的檢測步驟如下：

（1）水牛乳基因組DNA待測樣品的PCR擴增

（1.1）在滅菌的eppendorf管中，分別加入：濃度為10μmol/μL的2個引物B1和B2貯存液各0.5μL，1μL濃度為10μmol/μL的引物C1貯存液；2μL濃度為10mM的dNTP貯存液；25μL的2×PCR?Reaction?Mix，內含200mM?Tris?HCl?pH?8.3，500mM?KCl，40mM?MgCl₂，2ug/mlBSA，1.5M?Sorbitol，0.1％TritonX-100；0.5μL酶活為5u/μL的Taq酶；加入2μL待測牛奶基因組DNA樣品，最后用ddH₂O補齊成總體積50μL的二重PCR反應體系；

(1.2)短暫離心后進行PCR擴增，PCR反應程序為：94℃預變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環；72℃后延伸10min；PCR反應和結束后于4℃保存。

（2）電泳分析PCR產物

配制2％的瓊脂糖凝膠，調整電泳儀至70V電泳約45min，置于凝膠成像分析系統觀測結果，如電泳產物只出現預期長度為220bp的水牛特異性基因片段，則為純水牛乳或制品；如只出現預期長度為346bp的牛屬特異性基因片段，則為假冒水乳或制品；如同時出現220bp的水牛和346bp的牛屬特異性基因片段，則為摻假水牛乳或制品。