[發(fā)明專利]微核酸-196a分子及-196b分子偵測口腔癌的方法及其引物、探針與試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210274004.X
• 申請日: 2012-08-03
• 公開（公告）號: CN103571936A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設計）人: 鄭恩加;呂雅情
• 申請（專利權）人: 長庚大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京天平專利商標代理有限公司 11239
• 代理人: 孫剛

技術領域

本發(fā)明提供一種將微核酸-196a(miR-196a)分子及微核酸-196b(miR-196b)分子運用于偵測口腔癌的方法，尤其以miR-196a分子及miR-196b分子作為口腔癌的腫瘤標記，分析潛在病患的生物檢體中miR-196a分子及miR-196b分子的表達量來推斷該潛在病患罹患口腔癌的方法。?

背景技術

血液腫瘤標志具有疾病偵測、預后及監(jiān)控治療結果的價值。因此，一個臨床上應用的血液型腫瘤標志可以提供更好的疾病控制。現(xiàn)行的血液型腫瘤標志有偵測大腸直腸癌的CEA、偵測肝癌的AFP與偵測攝護腺癌的PSA，過去也有報導指出SCC抗原與Cyfra21可以作為頭頸癌的偵測標志，但目前尚未提到有臨床使用的口腔癌偵測標志。此外，微核酸(miRNA)是內生性，不轉譯蛋白的小片段RNA，其利用結合到標的基因訊息RNA的3’不轉譯區(qū)域(3’UTR)，進而抑制標的基因轉譯而達到負向調控基因表達。微核酸被認為是一群重要的基因調控分子，估計有1/3-1/2的人類基因會受微核酸調控，此外每個微小RNA亦可以同時調控不同的標的基因。已知微核酸參與多樣的生物功能，如細胞增生、分化、凋亡及移行功能，甚至微核酸表達異常也認為與細胞惡性轉化有關。近年來研究顯示，許多不同的癌癥都有其特異的微核酸表達，然而研究顯示共同的結果并不多，表示微核酸的復雜性及其機制并未被真正了解。?

目前口腔癌是十大癌癥之一，每年約以五十萬人的新病例增加，為改善醫(yī)療成效，提升口腔癌患者的存活率，除了改善治療的方式外，發(fā)現(xiàn)并建立一個臨床上可以用來偵測以及監(jiān)控病程的腫瘤標志，可有效減少口腔癌病人的死亡率。?

發(fā)明內容

目前并無適當?shù)姆肿幽[瘤標志，可應用于口腔癌的臨床偵測，為了改善醫(yī)療成效，提升口腔癌患者的存活率，本發(fā)明提供一種以將微核酸-196a(miR-196a)分子及微核酸-196b(miR-196b)分子運用于偵測口腔癌的方法，是分析潛在病患的腫瘤組織、血漿、血清、口水或漱口水等生物檢體中miR-196a分子及miR-196b分?子的表達量，其中miR-196a分子具有SEQID?NO：1所示的核苷酸序列，miR-196b分子具有SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列，若miR-196a分子或miR-196b分子的表達量異常高于正常值(其中，miR-196a的正常值為1.817±0.38，miR-196b的正常值為7.683±1.88)，即可推斷該潛在病患罹患口腔癌。?

以血漿檢體為例，又本發(fā)明分析潛在病患的生物檢體中miR-196a分子及miR-196b分子的表達量的分析步驟為：步驟一：首先取得血漿檢體，將血漿樣分裝出200μl，用可純化miRNA的試劑組來萃取出微核酸(miRNA)，第一步加入700μl?QIAzol使其均質化后再加入140μl氯仿分離萃取RNA，離心之后取上清液(約525μl)加入750μl純乙醇沉淀核酸產物，然后用離心管柱分離出沉淀物，丟棄下層流出液，在潤洗管柱后，每個樣本用20μl無核酸水解酶(RNase-free)的水將核酸提取出來；步驟二：微核酸(miRNA)的定量，微核酸的定量方式是用反轉錄實時熒光定量PCR反應試劑進行，首先將所萃取的核酸取3μl進行反轉錄反應，30μl反應體系包含4單位的反轉錄酶、10單位的核酸水解酶抑制劑及25mM?dNTP，置于37℃孵育30分鐘，接著用實時熒光定量PCR檢測儀進行實時熒光定量PCR檢測，方法為：將8μl反轉錄后的產物與1μl上述用于偵測miR-196a分子或miR-196b分子表達量的引物和探針混和，并加入6μl水和10μl實時熒光定量PCR試劑后上機，結果以Ct值(threshold?cycle)顯示，以已知濃度的miR-196a分子及miR-196b分子的檢測結果為對照，根據(jù)對照的Ct值及檢體的Ct值，得到檢體中miR-196a分子及miR-196b分子的表達量。?

本發(fā)明一種用實時熒光定量PCR法偵測miR-196a分子和miR-196b分子表達量的引物和探針，其中，檢測miR-196a的上游引物、下游引物及探針序列存在于Applied?Biosystems-?MicroRNA?Assays試劑盒(miR-196a：000495)中，檢測miR-196b的上游引物、下游引物及探針序列存在于Applied?Biosystems-?MicroRNA?Assays試劑盒(miR-196b：002215)中。?