[發(fā)明專利]微核酸-196a分子及-196b分子偵測(cè)口腔癌的方法及其引物、探針與試劑盒

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210274004.X
• 申請(qǐng)日: 2012-08-03
• 公開（公告）號(hào): CN103571936A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭恩加;呂雅情
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 長(zhǎng)庚大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京天平專利商標(biāo)代理有限公司 11239
• 代理人: 孫剛

1.用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法偵測(cè)miR-196a分子和miR-196b分子表達(dá)量的引物和探針，其中，檢測(cè)miR-196a的上游引物、下游引物及探針序列存在于Applied?Biosystems-MicroRNA?Assays試劑盒(miR-196a：000495)中，檢測(cè)miR-196b的上游引物、下游引物及探針序列存在于Applied?Biosystems-MicroRNA?Assays試劑盒(miR-196b：002215)中。

2.一種用miR-196a分子和miR-196b分子偵測(cè)口腔癌的方法，是用權(quán)利要求1所述的引物、探針和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析潛在病患的生物檢體中miR-196a分子及miR-196b分子的表達(dá)量，其中miR-196a分子具有SEQID?NO：1所示的核苷酸序列，miR-196b分子具有SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列，若miR-196a分子或miR-196b分子的表達(dá)量異常高于正常值，即可推斷該潛在病患罹患口腔癌，其中，miR-196a的正常值為1.817±0.38，miR-196b的正常值為7.683±1.88。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述miR-196a分子高出正常值約14倍。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述miR-196b分子高出正常值約10倍。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述生物檢體可為腫瘤組織、血漿、血清、口水或漱口水。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：以血漿檢體為例，所述分析潛在病患的生物檢體中miR-196a分子及miR-196b分子的表達(dá)量的分析步驟為：

步驟一：首先取得血漿檢體，將血漿樣分裝出200μl，用可純化miRNA的試劑萃取出微核酸(miRNA)，第一步加入700μl?QIAzol使其均質(zhì)化后再加入140μl氯仿分離萃取RNA，離心后取上清液(約525μl)加入750μl純乙醇沉淀微核酸，然后用離心管柱分離出沉淀物(微核酸)，丟棄下層流出液，潤(rùn)洗管柱后，每個(gè)樣本用20μl無核酸水解酶(RNase-free)的水將微核酸提取出來；

步驟二：微核酸的定量，微核酸的定量方式是用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)試劑進(jìn)行，首先取步驟一萃取的3μl微核酸進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在30μl反應(yīng)體系中加入4單位的反轉(zhuǎn)錄酶、10單位的核酸水解酶抑制劑及25mM?dNTP，置于37℃孵育30分鐘，接著用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，方法為：將8μl反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物與1μl權(quán)利要求1所述的偵測(cè)miR-196a分子或miR-196b分子表達(dá)量的引物和探針混和，并加入6μl水和10μl實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑后上機(jī)，結(jié)果以Ct值(threshold?cycle)顯示，以已知濃度的miR-196a分子及miR-196b分子的檢測(cè)結(jié)果為對(duì)照，根據(jù)對(duì)照的Ct值及檢體的Ct值，得到檢體中miR-196a分子及miR-196b分子的表達(dá)量。

7.一種用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法偵測(cè)口腔癌的試劑盒，包括偵測(cè)miR-196a分子和miR-196b分子表達(dá)量的引物和探針；所述檢測(cè)miR-196a的上游引物、下游引物及探針序列為Applied?Biosystems-MicroRNA?Assays試劑盒(miR-196a：000495)中的引物和探針；所述檢測(cè)miR-196b的上游引物、下游引物及探針序列為Applied?Biosystems-MicroRNA?Assays試劑盒(miR-196b：002215)中的引物和探針。

8.一種用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法偵測(cè)口腔癌的試劑盒，由偵測(cè)miR-196a分子和miR-196b分子表達(dá)量的引物和探針組成；所述檢測(cè)miR-196a的上游引物、下游引物及探針序列為Applied?Biosystems-MicroRNA?Assays試劑盒(miR-196a：000495)中的引物和探針；所述檢測(cè)miR-196b的上游引物、下游引物及探針序列為Applied?Biosystems-MicroRNA?Assays試劑盒(miR-196b：002215)中的引物和探針。