[發(fā)明專利]一種擬穴青蟹基于微衛(wèi)星標記的系譜認證方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210273613.3
• 申請日: 2012-08-02
• 公開（公告）號: CN102816843A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發(fā)明（設計）人: 馬洪雨;馬群群;馬凌波;馬春艷;喬振國
• 申請（專利權）人: 中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識產(chǎn)權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達;謝文凱

技術領域

本發(fā)明屬于擬穴青蟹養(yǎng)殖分子標記輔助育種領域，特別涉及一種擬穴青蟹基于微衛(wèi)星標記的系譜認證方法。

背景技術

擬穴青蟹(Scylla?paramamosain)屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹屬(Scylla)，在我國主要分布于長江口及以南沿海海域，是我國重要的海洋漁業(yè)資源和海水養(yǎng)殖蟹類。擬穴青蟹具有體型大、生長快、肉味鮮美等優(yōu)點，頗受廣大消費者青睞。近年來，我國擬穴青蟹的人工養(yǎng)殖年產(chǎn)量一直穩(wěn)定在10萬噸以上，保持了健康的發(fā)展勢頭。

在擬穴青蟹家系選擇育種中，需要將培育的多個家系混合在一個池塘中進行養(yǎng)殖，以保持養(yǎng)殖環(huán)境等因素的一致性，并對不同家系的生長、抗逆性能進行評價，從而選擇表現(xiàn)優(yōu)秀的家系進行育種。育種學家常采用物理標記，如：注射熒光粉的方法對混養(yǎng)的家系進行區(qū)分。由于擬穴青蟹等甲殼類動物營蛻殼生長方式，因此，隨著蛻殼次數(shù)的增加，物理標記將隨之減弱或消失。采用分子標記的方法進行輔助育種，能夠起到很好的效果。微衛(wèi)星標記是一種共顯性分子標記，已經(jīng)在動物新品種選育中得到了應用。目前，尚未見微衛(wèi)星分子標記在擬穴青蟹選擇育種中應用的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種擬穴青蟹基于微衛(wèi)星標記的系譜認證方法，該方法能夠克服物理標記的不足，可準確、有效區(qū)分擬穴青蟹不同家系來源的個體，適用于家系選育中鑒定混合養(yǎng)殖的多家系來源的不同個體，將促進擬穴青蟹人工選育工作健康、快速發(fā)展，具有良好的應用前景。

本發(fā)明的一種擬穴青蟹基于微衛(wèi)星標記的系譜認證方法，包括：

（1）取擬穴青蟹肌肉組織100-150mg，置于500~600μl組織提取液中剪碎，加入終濃度為20~25mg/ml的蛋白酶K和終濃度為100~110μg/ml的RNase?A，55~60℃下消化2-3個小時；用混合液抽提，然后用組織提取液2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，再經(jīng)乙醇洗滌和自然干燥后，溶解于50~60μl?TE緩沖液中；最后將DNA濃度稀釋為100~110ng/μl，并保存在-20℃?zhèn)溆茫?/p>

（2）采用微衛(wèi)星引物對上述得到的待檢測個體的DNA進行PCR擴增；

（3）采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR擴增產(chǎn)物，對PCR擴增產(chǎn)物進行染色和顯色，根據(jù)擴增產(chǎn)物的不同遷移距離確定擬穴青蟹個體的基因型；

（4）利用軟件對上述擬穴青蟹基因型進行分析得到聚類圖譜，用以區(qū)分擬穴青蟹個體。

所述步驟（1）中的組織提取液的組分為10mmol/L?Tris-Cl,pH8.0；100mmol/L?EDTA,pH8.0；100mmol/L?NaCl；0.5wt%SDS。

所述步驟（1）中的混合液為體積比25:24:1的苯酚、氯仿和異戊醇。

所述步驟（1）中的TE緩沖液的組分為10mmol/L?Tris-HCl，pH8.0；10mmol/L?EDTA，pH8.0。

所述步驟（2）中的微衛(wèi)星引物共7對，如表1所示：

表1本發(fā)明所用的7對微衛(wèi)星引物的序列、退火溫度及GenBank登陸號

其中，F(xiàn)指上游引物，R指下游引物。

所述步驟（2）中的PCR擴增條件為：

PCR反應體系包括：基因組DNA模板1μl、終濃度均為0.4μmol/L的上下游引物、終濃度為1.5mmol/L?Mg²⁺、終濃度為0.2mmol/L?dNTP、0.75U?Tag?DNA聚合酶和1×PCR?buffer，最后補充滅菌雙蒸水至總體積為25μl；

PCR反應程序為：94℃預變性5分鐘，94℃變性30秒，特異性退火溫度退火50秒，72℃延伸50秒，30個循環(huán)；最后于72℃延伸7分鐘。

所述步驟（3）中的變性聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)量百分比濃度為6%。

所述步驟（4）中的利用軟件對擬穴青蟹基因型進行分析具體為：將擬穴青蟹基因型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為生物學軟件NTsys2.1所識別的格式，根據(jù)使用說明書的提示，計算得到兩兩個體間的遺傳距離；再將距離矩陣輸入軟件MEGA4.0，采用UPGMA法進行聚類分析，即得聚類圖譜。

有益效果