[發明專利]一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法

無效

• 申請號: 201210273613.3
• 申請日: 2012-08-02
• 公開（公告）號: CN102816843A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 馬洪雨;馬群群;馬凌波;馬春艷;喬振國
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院東海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達;謝文凱

1.一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法，包括：

（1）取擬穴青蟹肌肉組織100-150mg，置于500~600μl組織提取液中剪碎，加入終濃度為20~25mg/ml的蛋白酶K和終濃度為100~110μg/ml的RNase?A，55~60℃下消化2-3個小時；用混合液抽提，然后用組織提取液2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，再經乙醇洗滌和自然干燥后，溶解于50~60μl?TE緩沖液中；最后將DNA濃度稀釋為100～110ng/μl，并保存在-20℃備用；

（2）采用微衛星引物對上述得到的待檢測個體的DNA進行PCR擴增；

（3）采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR擴增產物，對PCR擴增產物進行染色和顯色，根據擴增產物的不同遷移距離確定擬穴青蟹個體的基因型；

（4）利用軟件對上述擬穴青蟹基因型進行分析得到聚類圖譜，用以區分擬穴青蟹個體。

2.根據權利要求1所述的一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法，其特征在于：所述步驟（1）中的組織提取液的組分為10mmol/L?Tris-Cl,pH8.0；100mmol/L?EDTA,pH8.0；100mmol/L?NaCl；0.5wt%SDS。

3.根據權利要求1所述的一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法，其特征在于：所述步驟（1）中的混合液為體積比25:24:1的苯酚、氯仿和異戊醇。

4.根據權利要求1所述的一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法，其特征在于：所述步驟（1）中的TE緩沖液的組分為10mmol/L?Tris-HCl，pH8.0；10mmol/L?EDTA，pH8.0。

5.根據權利要求1所述的一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法，其特征在于：所述步驟（2）中的微衛星引物共7對，特征如下：

Scypa1:F:CCCTACCTACCATTACACCC；

R:TATTACAAAGGACAGCCAGACA；

退火溫度為53.5℃；

Scypa3:F:GCGGTTCATTTGCTTCG；

R:GAGACTGGGTTGTCCTTA；

退火溫度為54℃；

Scypa5:F:ATAGTTGCTGGTTGATGAAG；

R:GGTCTGCGGCGAAT；

退火溫度為54℃；

Scypa7:F:GCTCTGAGGCAAGAAG；

R:TTAGCCATACATCTCCCAT；

退火溫度為62℃；

Scypa8:F:ACGAGACAGAGGGAGGC；

R:GGG?TTCGAGATACAAGAT；

退火溫度為63℃；

Scypa11:F:AACGCTACATCATACTGC；

R:CTGTTGCTATTTCTGCTT；

退火溫度為48℃；

Scpa01:F:CGATTAACCATGCCTTAAAATAA；

R:ATCAGCTCAGGGCAAAACTGA；

退火溫度為54℃。

6.根據權利要求1所述的一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法，其特征在于：所述步驟（2）中的PCR擴增條件為：

PCR反應體系包括：基因組DNA模板1μl、終濃度均為0.4μmol/L的上下游引物、終濃度為1.5mmol/L?Mg²⁺、終濃度為0.2mmol/L?dNTP、0.75U?Tag?DNA聚合酶和1×PCR?buffer，最后補充滅菌雙蒸水至總體積為25μl；

PCR反應程序為：94℃預變性5分鐘，94℃變性30秒，特異性退火溫度退火50秒，72℃延伸50秒，30個循環；最后于72℃延伸7分鐘。

7.根據權利要求1所述的一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法，其特征在于：所述步驟（3）中的變性聚丙烯酰胺凝膠質量百分比濃度為6%。

8.根據權利要求1所述的一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法，其特征在于：所述步驟（4）中的利用軟件對擬穴青蟹基因型進行分析具體為：將擬穴青蟹基因型數據轉換為生物學軟件NTsys2.1所識別的格式，根據使用說明書的提示，計算得到兩兩個體間的遺傳距離；再將距離矩陣輸入軟件MEGA4.0，采用UPGMA法進行聚類分析，即得聚類圖譜。