[發(fā)明專利]包括基于金黃色葡萄球菌A蛋白的新配體的層析基質(zhì)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210273398.7
• 申請日: 2012-06-08
• 公開（公告）號: CN102895960A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: S·斯佩克特;R·史密斯;J·奧蘭多;N·比安
• 申請（專利權(quán)）人: EMD密理博公司
• 主分類號: B01J20/281
• 分類號: B01J20/281;B01D15/26;G01N30/00;G01N33/566
• 代理公司: 永新專利商標(biāo)代理有限公司 72002
• 代理人: 左路;林曉紅

相關(guān)申請

本申請要求2011年6月8日提交的美國臨時專利申請61/494701的優(yōu)先權(quán)，在此通過援引的方式將其全部內(nèi)容并入本申請。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及層析基質(zhì)，其包括基于免疫球蛋白結(jié)合蛋白(如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus)A蛋白(SpA))的一個或多個結(jié)構(gòu)域的配體，也涉及它們的使用方法。

背景技術(shù)

用于親和層析的配體通常對于靶分子具有高選擇性，從而能夠以高產(chǎn)率、高純度、快速且經(jīng)濟(jì)的方式純化靶分子。基于金黃色葡萄球菌A蛋白的試劑和層析介質(zhì)已經(jīng)在親和層析領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，用于捕獲和純化抗體和含有Fc的蛋白；由于其能夠結(jié)合IgG，且不會顯著影響免疫球蛋白與抗原的親和力，因此在規(guī)模化分析抗體檢測方法中也得到廣泛應(yīng)用。

因此，包含A蛋白配體的各種試劑和介質(zhì)已經(jīng)建立起來并通過商業(yè)途徑可以獲得，例如，-vA?High?Capacity、-vA?Ultra和UltraPlus(MILLIPORE)和Protein?A?Sepharose^TM、MabSelect^TM、MabSelect?Xtra^TM、MabSelect?SuRe^TM(GE?HEALTHCARE)、MabSelect?SuRe^TM?LX和Poros?MasCapture?A^TM(LIFE?TECHNOLOGIES)。

為了保持層析配體(包括配體結(jié)合型固相支持物如結(jié)合SpA的層析基質(zhì))的選擇性，基質(zhì)需要進(jìn)行清洗，而且通常在酸性或堿性條件下清洗，如用氫氧化鈉(NaOH)。例如，用于基質(zhì)清洗和再生的標(biāo)準(zhǔn)過程是堿性原位清洗(CIP)方法，其通常包括用濃度為0.05M-1M的NaOH處理結(jié)合配體的基質(zhì)，使pH范圍位于12.7-14.0。一般來講，將親和層析基質(zhì)進(jìn)行重復(fù)原位清洗循環(huán)會導(dǎo)致基質(zhì)對靶分子的結(jié)合能力隨清洗時間的延長而顯著喪失，從而整個過程需要更多量的通常很昂貴的與基質(zhì)結(jié)合的配體。由于這樣會導(dǎo)致純化過程更加昂貴并且時間延長，因此既不夠經(jīng)濟(jì)也不是所期望的。

發(fā)明內(nèi)容

基于A蛋白的層析基質(zhì)之前在現(xiàn)有技術(shù)中已有描述，其表現(xiàn)出在堿性條件下處理后對于靶分子的結(jié)合能力下降。參見，如公開號為20100221844的美國專利出版物描述的親和層析基質(zhì)以多點連接的方式將野生型(wt)SpA的B或Z結(jié)構(gòu)域結(jié)合到基質(zhì)上，即使用0.5M?NaOH處理5小時或更長時間，其也能達(dá)到起始結(jié)合能力的95％。此外，公開號為20100048876的美國專利出版物描述了一種結(jié)合了野生型SpA的C結(jié)構(gòu)域和含有3-6個氨基酸缺失的C結(jié)構(gòu)域的親和層析基質(zhì)，用0.5M?NaOH處理約5小時，其達(dá)到起始結(jié)合能力的95％。這些配體通過半胱氨酸引導(dǎo)的單點連接方式固定到基質(zhì)上。進(jìn)一步地，已經(jīng)有文獻(xiàn)描述了結(jié)合在一個或多個天冬氨酸位點含有突變的A蛋白的層析基質(zhì)，在堿性條件下處理后，其基質(zhì)顯示出結(jié)合能力相對于野生型SpA有所下降，其通過單點連接方式固定到基質(zhì)上。參見如US專利6831161。

盡管前述提到的親和層析基質(zhì)在苛性條件(caustic?conditions)下處理后，似乎顯示出對于靶分子的結(jié)合能力有所下降，但在苛性條件下處理后，其中許多基質(zhì)顯示出很大程度的配體片段化，如使用SDS-PAGE和/或尺寸排阻層析(SEC)可以觀察到。由于很大程度的配體片段化產(chǎn)生的配體小片段難以從靶分子中去除和分離，從而增加潛在的免疫原性片段與治療性靶分子共純化的可能，因此這種片段化是不利的。此外，很大程度的片段化導(dǎo)致加劇基質(zhì)與靶分子結(jié)合能力的下降。

本發(fā)明提供了親和層析配體和結(jié)合該配體的基質(zhì)，其中所述配體基于一個或多個金黃色葡萄球菌A蛋白(SpA)的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有從N末端第1位或第2位起始的缺失突變。這些配體和基質(zhì)在純化使用時的片段化問題相對于之前描述的配體有所下降，這一點通過SDS-PAGE和/或SEC技術(shù)可以證實，從而使得它們成為用于親和層析的更有吸引力和更加經(jīng)濟(jì)的選擇。

本發(fā)明的一個方面提供了親和層析基質(zhì)，其包括具有缺失突變的一個或多個SpA蛋白B結(jié)構(gòu)域，具有缺失突變的一個或多個SpA蛋白C結(jié)構(gòu)域或具有缺失突變的一個或多個SpA蛋白Z結(jié)構(gòu)域，其中一個或多個結(jié)構(gòu)域結(jié)合到固相支持物上。