[發(fā)明專利]檢測維生素B12的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210273343.6
• 申請日: 2012-08-02
• 公開（公告）號: CN103575914A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 萬宇平;吳鵬;羅曉琴;馮靜;楊秀賢;韓雪倩;顧蓉蓉;蒲小容
• 申請（專利權(quán)）人: 北京勤邦生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N33/82
• 分類號: G01N33/82;G01N33/558
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，具體涉及一種用于檢測維生素B12的酶聯(lián)免疫試劑盒，其適用于谷物類（玉米面、黃豆面、小米面、大米面）、牛奶、奶粉中維生素B12的測定。

技術(shù)背景

維生素是各種生物維持正常生理功能所必需的一類低分子有機(jī)化合物，它們大多數(shù)是生化代謝過程中的主要輔酶，在體內(nèi)參與、調(diào)節(jié)、控制許多合成和分解代謝，當(dāng)生物體缺乏維生素時，就會引發(fā)物質(zhì)代謝障礙，引起多種疾病。維生素B12又叫鈷胺素，其主要生理功能是參與制造骨髓紅細(xì)胞，防止惡性貧血，防止大腦神經(jīng)受到破壞。維生素B12對于促進(jìn)畜禽生長特別是在促進(jìn)幼畜生長發(fā)育方面效果顯著，在畜禽體內(nèi)主要以參與一碳單位和丙酸代謝發(fā)揮作用，影響遺傳物質(zhì)的合成，還能維持神經(jīng)功能的完整性，是畜禽不可缺少的營養(yǎng)原料。養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，常規(guī)飼料中的維生素B12一般作為安全用量，額外添加適量維生素B12可以提高畜禽生產(chǎn)性能，帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益。

近年來，余林梁等報道了以HPLC測定維生素H，鄧富良等用HPLC同時測定注射用水溶性維生素中維生素H和葉酸，任一平、龍朝陽等以HPLC測定食品中的葉酸，楊誼等以HPLC測定維生素B12。隋玉榮等用離子對色譜法測定了維生素B12及葉酸的含量，H.?B.Li、Heudi用不同波長同時測定了維生素H、葉酸和維生素B12，宋金春等通過優(yōu)化色譜條件，建立了同一波長條件下HPLC同時測定注射用水溶性維生素中維生素H、葉酸及維生素B12含量的方法。另外維生素B12的測定方法主要有比色法、電化學(xué)分析法、離子交換法、激光共振拉曼光譜法等，這些方法均是先測定樣品中?Co?含量，由鈷含量換算成VB12的含量，操作繁瑣，選擇性較差。劉保生等建立了利用AO-R6G?能量轉(zhuǎn)移熒光猝滅法測定維生素B12的新方法。免疫學(xué)檢測方法也應(yīng)用于維生素B12的檢測中，采用間接競爭ELISA方法測定維生素B12含量的方法，簡便、快速、靈敏度高，穩(wěn)定性好，能滿足維生素B12的現(xiàn)場大批量樣品的快速篩選。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對上述不足提供一種用于維生素B12含量測定的酶聯(lián)免疫試劑盒，其操作簡單適合現(xiàn)場大批量樣品的篩選。

本發(fā)明試劑盒，它包括：

（1）包被有維生素B12偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板；

（2）維生素B12特異性抗體；

（3）酶標(biāo)記抗抗體；

（4）維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

（5）底物顯色液；

（6）終止液；

（7）濃縮洗滌液；

（8）復(fù)溶液。

所述維生素B12偶聯(lián)抗原為維生素B12半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，所述載體蛋白可為卵清蛋白、牛血清白蛋白、血藍(lán)蛋白、甲狀腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白。

所述維生素B12半抗原的結(jié)構(gòu)如下：

。

所述維生素B12半抗原制備過程：0.50g維生素B12、0.10g琥珀酸酐和1ml吡啶在20ml?DMSO中的混合液，在80℃下攪拌反應(yīng)40小時，蒸除溶劑，乙醇-水體系多次重結(jié)晶后得到鄰苯二甲酸單維生素B12酯，為維生素B12半抗原。

所述酶標(biāo)記抗抗體的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶；酶標(biāo)記抗抗體是采用過碘酸鈉法將標(biāo)記酶與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的。所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體。

所述維生素B12特異性抗體為維生素B12單克隆抗體，是用維生素B12偶聯(lián)抗原為免疫原免疫動物得到的；所述維生素B12特異性抗體可為鼠源、馬源、羊源或兔源抗體，所述維生素B12單克隆抗體優(yōu)選為維生素B12鼠單克隆抗體。

為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、復(fù)溶液。

所述的終止液為1~2mol/L的硫酸或鹽酸溶液，所述底物顯色液由底物液A液和底物液B液組成，底物液A液為過氧化脲溶液，底物液B液為四甲基聯(lián)苯胺溶液。

所述濃縮洗滌液為pH7.2~7.6，含0.5%~1.0%吐溫-20和0.01‰~0.05‰的疊氮化鈉防腐劑的0.1~0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量百分比。

所述的復(fù)溶液為pH值為7.0~7.2，含有5%~10%酪蛋白、0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量百分比。

其中酶標(biāo)板在制備過程中所用的包被緩沖液為pH9.0~9.6，0.1~0.2mol/L碳酸鹽緩沖液，所用封閉液為pH7.2~7.6，0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量百分比。