[發(fā)明專利]一種Cre融合蛋白功能檢測(cè)細(xì)胞及修飾后的Cre融合蛋白

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210271661.9
• 申請(qǐng)日: 2012-07-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102827873A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 余源;張涌;王勇勝;劉軍;權(quán)富生;田進(jìn)海;王易之;李仲夏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué);楊凌科元克隆股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N5/10;C12Q1/48;C12Q1/02;C12N9/12;C12N15/70
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 陸萬(wàn)壽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于重組功能檢測(cè)細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種Cre融合蛋白功能檢測(cè)細(xì)胞及修飾后的Cre融合蛋白。?

背景技術(shù)

Cre屬于重組酶家族，它是來(lái)源于P1噬菌體，能夠作用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞引起DNA序列特異性重組蛋白（Nagy?A:Cre?recombinase:the?universal?reagent?for?genome?tailoring.Genesis?2000,26:99-109）,它是由P1噬菌體編碼的大小為38kD的蛋白,能識(shí)別34bp大小的loxp位點(diǎn)。重組酶對(duì)底物的構(gòu)形要求不嚴(yán)格，可以是超螺旋DNA，也可以是線性DNA。在Cre酶的作用下，兩個(gè)同向loxp位點(diǎn)之間的DNA片段將會(huì)被刪除;兩個(gè)反向loxp位點(diǎn)之間的DNA將會(huì)發(fā)生翻轉(zhuǎn)(Hoess?R?H,Abremski?K.Mechanism?of?strand?cleavage?and?exchange?in?the?Cre?lox?site?specific?recombination?system[J].MolBiol,1985,181(3):351-362.)Cre酶介導(dǎo)的遺傳重組可進(jìn)行定點(diǎn)、定時(shí)、定組織的特異性控制。該系統(tǒng)于1981年被首次發(fā)現(xiàn)，1993年被Gu等（Gu?H,Zou?Y?R,Rajewsky?K.Independent?control?of?immunoglobulin?switch?recombination?at?individual?switch?regions?evidenced?through?Cre-LoxP-mediated?gene?targeting[J].Cell,1993,73(6):1155-1164.）研究人員正式作為一種基因操作手段應(yīng)用以來(lái)已廣泛地應(yīng)用于基因克隆、基因捕獲、基因整合、基因刪除等研究領(lǐng)域并體現(xiàn)出巨大優(yōu)勢(shì)。?

Cre重組酶通過(guò)對(duì)DNA進(jìn)行準(zhǔn)確切割和重新連接，能夠介導(dǎo)靶DNA發(fā)生包括倒位、易位、切離或整合等形式的重排，從而使得在染色體水平對(duì)真核生物基因組進(jìn)行遺傳改造，以及對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)進(jìn)行有效的控制成為可能。該系統(tǒng)目前已成為在特定基因的刪除、基因功能的鑒定、外源基因的定點(diǎn)整合、基因捕獲以及染色體工程等方面進(jìn)行研究的有?力工具，并在轉(zhuǎn)基因的酵母、植物、昆蟲、哺乳動(dòng)物的體內(nèi)外DNA重組方面得到廣泛的應(yīng)用。?

因此，有必要構(gòu)建一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞系。目前用于構(gòu)建的檢測(cè)cre/loxp系統(tǒng)效率的元件，多為將一個(gè)組成型啟動(dòng)子和一種報(bào)告基因中間用多個(gè)順式串聯(lián)的轉(zhuǎn)錄終止子阻斷，終止子兩側(cè)有兩個(gè)同向LoxP，然后通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染或者病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式，隨機(jī)整合（或其他方法）或定點(diǎn)打靶到哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組上。但是，這種隨機(jī)整合（或其他方法）可能產(chǎn)生以下情況：1.插入突變：病毒載體介導(dǎo)的整合容易導(dǎo)致插入突變引起細(xì)胞建系失敗；2.基因沉默：而非病毒載體的隨機(jī)整合也容易整合到異染色質(zhì)區(qū)，引起轉(zhuǎn)基因沉默，使得新建立的細(xì)胞系無(wú)法正常表達(dá)報(bào)告基因，而不能正常指示cre切割效率；3.非單拷貝整合：在排除前兩種情況的前提下，假定非病毒載體隨機(jī)整合位點(diǎn)均位于轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，如果發(fā)生了非單拷貝整合，除了可能影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)外，多余的LoxP序列也會(huì)影響到Cre重組酶功能的驗(yàn)證。?

而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，鏈霉菌噬菌體c31整合酶被證明是可以與基因組DNA中特異性序列（即假attP位點(diǎn)）進(jìn)行反應(yīng)的整合酶，它可以將外源基因穩(wěn)定地整合到哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的那些特定的序列上，其偏向于以單拷貝整合到基因組轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，從而極大降低了外源基因隨機(jī)插入造成的基因突變風(fēng)險(xiǎn)。已被發(fā)現(xiàn)的c31整合酶識(shí)別的細(xì)胞基因組特異性位點(diǎn)有一百多個(gè)，對(duì)整合位點(diǎn)的生物信息學(xué)分析表明它們有較好的安全性（T.W.Chalberg,et?al.Integration?specificity?of?phiC31?integrase?in?the?human?genome.J?Mol?Biol.2006.357.28-48），提示其作為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行基因操作和基因治療的一個(gè)有用的工具，適合用于驗(yàn)證Cre穿膜肽效率細(xì)胞系的構(gòu)建，即介導(dǎo)含有驗(yàn)證元件的載體以單拷貝的形式整合到哺乳動(dòng)物基因組轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，從而正常行使其驗(yàn)證Cre融合蛋白穿膜能力和生物學(xué)活性的功能。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的問(wèn)題在于一種Cre融合蛋白功能檢測(cè)細(xì)胞及修飾后的Cre融合蛋白，以驗(yàn)證Cre融合蛋白的穿膜效率和生物活性，從而優(yōu)化Cre融合蛋白在相關(guān)基因工程領(lǐng)域的應(yīng)用。?

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：?