[發明專利]一種Cre融合蛋白功能檢測細胞及修飾后的Cre融合蛋白

無效

• 申請號: 201210271661.9
• 申請日: 2012-07-31
• 公開（公告）號: CN102827873A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 余源;張涌;王勇勝;劉軍;權富生;田進海;王易之;李仲夏
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學;楊凌科元克隆股份有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12Q1/48;C12Q1/02;C12N9/12;C12N15/70
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

1.一種Cre融合蛋白功能檢測載體，其特征在于，包括Pcmv?IE啟動子，在Pcmv?IE啟動子的上游設有attB序列，Pcmv?IE啟動子的下游設有兩個同向的Loxp序列，兩個同向的Loxp序列之間依次設有BGH終止子、BGH終止子和SV40A終止子，Loxp序列的下游設有熒光標記基因及抗生素篩選基因；當Loxp序列及其之間的三個終止子在Cre重組酶作用下剪切后，Pcmv?IE啟動子和熒光標記基因拼接，啟動熒光標記基因的表達。

2.如權利要求1所述的Cre融合蛋白功能檢測載體，其特征在于，所述的載體為pAcmv-stop-EGFP，包括以下元件及連接順序：attB序列-Pcmv?IE啟動子-Loxp序列-BGH終止子-BGH終止子-SV40A終止子-Loxp序列-熒光標記基因-抗生素篩選基因；

所述的熒光標記基因為EGFP基因閱讀框，抗生素篩選基因為neo，該載體稱為載體。

3.如權利要求1所述的Cre融合蛋白功能檢測載體，其特征在于，所述pAcmv-stop-EGFP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

4.一種Cre融合蛋白功能檢測細胞，其特征在于，宿主細胞為HEK293細胞，將pAcmv-stop-EGFP載體和phiC31整合酶表達載體pCMVint共轉染宿主細胞；利用G418抗性篩選陽性轉染的重組細胞，并篩選其中attB-CMV-stop-EGFP表達載體以單拷貝的形式整合入宿主細胞假attP位點的細胞。

5.權利要求4所述的Cre融合蛋白功能檢測細胞在檢測Cre融合蛋白剪切活性中的應用。

6.如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的Cre融合蛋白是具有蛋白轉導功能的穿膜肽和核定位信號修飾的Cre融合蛋白。

7.一種經TAT和NLS多肽修飾的Cre融合蛋白，其特征在于，從N端開始分別為6×His區域、NLS多肽區域、TAT多肽區域和Cre酶區域；其中NLS多肽區域的氨基酸殘基的序列為：Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val，AT多肽區域的氨基酸殘基的序列為：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg。

8.一種權利要求7所述的TAT和NLS多肽修飾的Cre融合蛋白的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：

1）PCR擴增得到帶有SacI和XhoI識別序列的Cre核苷酸序列，將擴增產物經過SacI和XhoI酶切后，回收連接到同樣經過SacI和XhoI酶切的原核表達載體pET28a(+)上，得到pET28a-Cre重組質粒；

2）由引物退火產生帶有NdeI和SacI識別序列粘性末端的NLS-TAT核苷酸序列，并將其連接到經過NdeI和SacI酶切的pET28a-Cre重組質粒，得到pET28a-HNTC重組質粒；

3）將pET28a-HNTC重組質粒轉化到大腸桿菌BL21菌株中，挑選5-8個陽性的菌落接種在卡那霉素抗性的LB培養基中，在16～22℃用0.2mM?IPTG誘導表達Cre融合蛋白；

4）誘導表達蛋白的細菌經過超聲波破碎菌體，釋放出融合蛋白后，經過Ni離子螯合的親和層吸柱純化，得到純化后的蛋白。