[發明專利]一種VEFG受體酶聯診斷試劑盒及其制備方法

無效

• 申請號: 201210271348.5
• 申請日: 2012-07-31
• 公開（公告）號: CN102854322A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 吳克
• 申請（專利權）人: 吳克
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 何新平

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體地說涉及一種檢測人血管內皮細胞生長因子(VEGF)的酶聯檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術

腫瘤的發展和轉移是多階段的、復雜的、具有高度選擇性的過程，涉及腫瘤細胞與宿主之間錯綜復雜的關系，其機理尚不甚清楚。近年來關于新的血管生成與腫瘤發展、轉移和預后關系的研究進展迅速，證明新的血管生成是腫瘤生成、轉移和轉移灶生長的必要條件，血管內皮細胞生長因子(VEGF)是調節新血管生成的最重要的細胞因子。研究表明血管內皮細胞生長因子(VEGF)在血管系統的發育分化中具有不可替代的作用。

VEGF是一個分子量為45KD的高度糖基化的堿性蛋白，有兩個相同亞單位通過二硫鍵結合形成，等電點為8.5，有很強的耐熱和耐酸能力。人VEGF基因有5種不同的異構體，分別為VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF145、VEGF121。VEGF高親和力結合位點僅位于血管內皮細胞上昀3種VEGF受體，即VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3，這3種受體主要分布于血管內皮細胞表面，均是跨膜受體。研究表明，VEGF受體在體外與VEGF有高度的親和力(Kendall?et?al．PNAS?USA，1993，90:10705-9)。VEGF是癌癥生長、轉移所必需的一種因子。目前研究表明，在人類各種惡性腫瘤(即癌癥)疾病中，VEGF的分泌增加有著普遍性和廣泛性。有大量文獻報道，VEGF在正常人和癌癥患者中的濃度明顯不同，正常人中的VEGF濃度很低或檢測不到，而在癌癥患者中VEGF濃度很高。因此，檢測人血液中的VEGF濃度，能夠用于癌癥的早期普查診斷。另一方面，VEGF在人體血液中的濃度隨腫瘤的消長情況而變化。腫塊大、生長快時，VEGF的血液濃度就高；而當腫瘤因化療或手術“臨床治愈”時，VEGF的血液濃度降低。故VEGF得檢測可作為療效觀察和預后的指標。VEGF是惡性腫瘤診斷中的一個重要組成部分。另外，血液VEGF水平增高亦見于糖尿病、血管炎癥性疾病、某些免疫性疾病和妊娠等。

現有技術中關于VEGF的生物檢測方法，存在靈敏度較低、穩定性不佳等問題。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題，本發明的目的是提供一種酶聯免疫檢測人血管內皮細胞生長因子(VEGF)的檢測試劑盒。本發明提供的試劑盒結果準確穩定、特異性強、靈敏度高、使用方便、便于推廣。

本發明的另一目的是提供上述酶聯檢測試劑盒的生產制備及使用方法。

為實現上述目的，本發明提供一種VEGF受體酶聯診斷試劑盒，包括：酶聯板、陽性對照、陰性對照、樣品稀釋液、酶聯物、濃縮洗滌液、顯色劑A＆B、終止液和封板膠紙；

其中：酶聯板為血管內皮細胞生長因子(VEGF)受體包被的酶聯反應板；

酶聯物為辣根過氧化物酶標記血管內皮生長因子單克隆抗體。

作為進一步優選方案，所述陽性對照為血管內皮細胞生長因子蛋白凍干粉；

所述陰性對照為動物血清凍干粉；

所述樣品稀釋液為0.05%吐溫-20～80，l%牛血清白蛋白，l0mM乙二胺四乙酸二鈉，0.05%硫柳汞，0.4M?NaCl，pH6.5；

所述濃縮洗滌液為137mM?NaCl，2.7mM?KC1，10mMNa2HP04，2mMKH₂P0₄，0.05%吐溫20，Ph7.4：

所述顯色劑A液為H₂O₂溶液，所述顯色劑B液為3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺溶液；

所述終止液為2MH₂S0₄溶液。

作為進一步優選方案，上述各物質的量以酶聯板的孔數為標準。

作為進一步優選方案，所述酶聯板為96孔。

一種上述VEGF受體酶聯檢測試劑盒的制備和操作方法，主要步驟為：

(a)將血管內皮細胞生長因子受體包被于固體支持物酶聯反應板上；

(b)用封閉液封閉；

(c)特生物標本加入到預包被的酶聯反應板反應孔中，生物標本中的血管內皮細胞生長因子特異地與血管內皮細胞生長因子受體結合；

(d)用血管內皮細胞生長因子單克隆抗體檢測血管內皮細胞生長因子；

(e)顯色底物為3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺溶液。

作為進一步優選方案，步驟a所述的血管內皮細胞生長因子受體用昆蟲細胞表達。