[發明專利]核酸探針及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201210269087.3
• 申請日: 2012-07-31
• 公開（公告）號: CN102839168A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發明（設計）人: 耿春雨;韓鴻雁;盧志遠;章文蔚;祝珍珍
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因研究院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/11;C12Q1/68;C40B50/06;C40B40/06
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地，本發明涉及核酸探針及其制備方法和應用，更具體地，本發明涉及制備探針的方法、核酸探針、核酸探針在制備測序文庫中的用途、制備宏基因組測序文庫的方法、宏基因組測序文庫以及確定宏基因組序列信息的方法。

背景技術

目前，宏基因組學已經成為基因組學中的一個新興的重要科學研究領域，是研究直接從環境樣本例如人類胃腸道、土壤等中直接提取基因組遺傳物質，并進行相關分析的學科。宏基因組學研究的快速發展，使得大規模的宏基因組學研究相繼展開，大量新的微生物種群和新的基因將得以發現，對人類健康將有積極的現實意義，為后續研究腸道微生物與人的肥胖、腸炎、糖尿病等疾病的關系提供非常重要的理論依據，達到預防和監控的目的。

然而，宏基因組所研究的樣本在提取過程中很難避免宿主基因組的污染，例如人腸道環境的宿主基因組污染約2%-3%，而在口腔、生殖道、皮膚、呼吸道等部位獲取的樣本DNA中宿主基因組污染的比例均達到80%甚至90%以上。樣本中大量宿主外源污染的存在使得有效數據的測序成本相對大大增加。第二代高通量測序使得從全基因組角度研究環境樣本中各個組分成為可能，但是對于宿主樣本高污染的樣本DNA則需要耗費極大的測序通量才能夠達到預期的測序效果。

因而，目前的宏基因組研究方法仍有待改進。

發明內容

本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一或至少提供一種有用的商業選擇。為此，本發明的一個目的在于提出一種能有效對宏基因組測序文庫進行篩選的手段。

在本發明的第一方面，本發明提出了一種制備探針的方法。根據本發明的實施例，該方法包括以下步驟：將DNA樣本進行片段化，以便獲得第一DNA片段；將所述第一DNA片段進行平端化，以便獲得經過平端化的第一DNA片段；將所述經過平端化的第一DNA片段與接頭進行連接，以便獲得連接接頭的第一DNA片段；利用PCR引物組對所述連接接頭的第一DNA片段進行擴增，以便得到第一擴增產物，所述PCR引物組包括第一PCR引物和第二PCR引物，所述第一PCR引物和第二PCR引物的5’末端堿基均被生物素標記，所述第一擴增產物構成雙鏈DNA探針。由此，通過該方法最終得到的產物可以有效地作為雙鏈DNA探針，進一步可以將這些所得到的雙鏈DNA探針應用于宏基因組（與雙鏈DNA探針屬于相同宿主來源）的測序文庫的構建，可以有效地去除其他來源DNA對測序文庫的污染，例如，可以有效地應用于宏基因組測序文庫的構建，有效地去除宿主DNA對宏基因組測序文庫的污染，有效地提高宏基因組測序的準確性。

在本發明的第二方面，本發明提出了核酸探針。根據本發明的實施例，所述核酸探針可以根據前面所述的方法獲得。這些核酸探針可以有效地作為雙鏈或單鏈DNA探針，進一步可以將這些所得到的雙鏈或者單鏈DNA探針應用于這些DNA樣本（與DNA探針屬于相同宿主來源）的測序文庫的構建，可以有效地去除其他來源DNA對測序文庫的污染，例如，可以有效地應用于宏基因組測序文庫的構建，有效地去除宿主DNA對宏基因組測序文庫的污染，有效地提高宏基因組測序的準確性。另外，前面針對探針制備方法中所描述的其他特征和優點，同樣適于該核酸探針，為方便，不再贅述。

在本發明的第三方面，本發明還提出了前面所述核酸探針在制備測序文庫中的用途。

在本發明的第四方面，本發明提出了一種制備宏基因組測序文庫的方法。根據本發明的實施例，該制備宏基因組測序文庫的方法包括：根據前面所述的方法，利用宿主基因組DNA制備探針；將用于構建測序文庫的宏基因組DNA進行片段化，以便獲得第二DNA片段；將所述第二DNA片段進行平端化，以便獲得經過平端化的第二DNA片段；在所述經過平端化的DNA片段的3’末端添加堿基A，以便獲得3’末端添加堿基A的第二DNA片段；將所述3’末端添加堿基A的第二DNA片段與接頭進行連接，以便獲得連接接頭的第二DNA片段；以及將所述連接接頭的第二DNA片段進行擴增，以便獲得第二擴增產物，所述第二擴增產物構成所述宏基因組測序文庫，其中，利用所述探針對文庫構建中間產物進行篩選以便獲得經過純化的文庫構建中間產物，所述文庫構建中間產物為所述第二DNA片段、經過平端化的第二DNA片段和連接接頭的第二DNA片段的至少之一。由此，可以有效地構建宏基因組測序文庫，根據本發明的實施例，根據本發明實施例的方法制備的DNA探針可以有效地對文庫構建中間產物進行篩選，由此，可以除去最終所得到測序文庫中來自宿主DNA的污染，對測序文庫進行純化，有效地提高宏基因組測序的準確性。