[發明專利]核酸探針及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201210269087.3
• 申請日: 2012-07-31
• 公開（公告）號: CN102839168A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發明（設計）人: 耿春雨;韓鴻雁;盧志遠;章文蔚;祝珍珍
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因研究院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/11;C12Q1/68;C40B50/06;C40B40/06
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

1.一種制備探針的方法，其特征在于，包括以下步驟：

將DNA樣本進行片段化，以便獲得第一DNA片段；

將所述第一DNA片段進行平端化，以便獲得經過平端化的第一DNA片段；

將所述經過平端化的第一DNA片段與接頭進行連接，以便獲得連接接頭的第一DNA片段；

利用PCR引物組對所述連接接頭的第一DNA片段進行擴增，以便得到第一擴增產物，所述PCR引物組包括第一PCR引物和第二PCR引物，所述第一PCR引物和第二PCR引物的5’末端堿基均被生物素標記，所述第一擴增產物構成雙鏈DNA探針。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA樣本含有至少一種生物的基因組DNA，

任選地，所述DNA樣本是從人基因組DNA提取的，

任選地，所述片段化是通過高壓氣體霧化處理、超聲處理、以及水力剪切處理的至少一種而進行的，

任選地，所述第一DNA片段的長度為100-200bp，

任選地，所述第一PCR??引物的核苷酸序列為：5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG-3’，所述第二PCR引物的核苷酸序列為：5’-CTGCCCCGGGTTCCTCATTCT-3’，

任選地，進一步包括對所述雙鏈DNA探針進行變性處理，以便得到單鏈DNA探針，

任選地，進一步包括將所述單鏈DNA探針與鏈霉親和素包被的磁珠連接。

3.核酸探針，其特征在于，所述核酸探針是根據權利要求1-2任一項所述的方法獲得的。

4.權利要求3所述的核酸探針在制備測序文庫中的用途。

5.一種制備宏基因組測序文庫的方法，其特征在于，包括：

根據權利要求1-2任一項所述的方法，利用宿主基因組DNA，制備探針；

將用于構建測序文庫的宏基因組DNA進行片段化，以便獲得第二DNA片段；

將所述第二DNA片段進行平端化，以便獲得經過平端化的第二DNA片段；

在所述經過平端化的第二DNA片段的3’末端添加堿基A，以便獲得3’末端添加堿基A的第二DNA片段；

將所述3’末端添加堿基A的第二DNA片段與接頭進行連接，以便獲得連接接頭的第二DNA片段；以及

將所述連接接頭的第二DNA片段進行擴增，以便獲得第二擴增產物，所述第二擴增產物構成所述宏基因組測序文庫，

其中，

利用所述探針對文庫構建中間產物進行篩選以便獲得經過純化的文庫構建中間產物，所述文庫構建中間產物為所述第二DNA片段、經過平端化的第二DNA片段和連接接頭的第二DNA片段的至少之一。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述宏基因組DNA是從人口腔、鼻腔、呼吸道、生殖道和皮膚的至少一種提取的，

任選地，所述宏基因組DNA來源于人口腔的唾液、口腔黏膜、扁桃體、咽和上牙齦牙菌斑的至少一種，

任選地，第二DNA片段的長度為250bp。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，在所述篩選過程中，所述探針與所述文庫構建中間產物的重量比為50：1，

任選地，所述篩選進一步包括：

將所述文庫構建中間產物與雜交試劑混合，進行雜交；

去除未發生雜交的探針，以便獲得經過純化的文庫構建中間產物，

任選地，將所述文庫構建中間產物與雜交試劑混合時，進一步包括添加以下三種封閉序列：

Block1：CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT；

Block2：CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCT；以及

Block3：TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT，

任選地，通過清洗去除未發生雜交的探針，利用DNA外切酶消化未發生雜交的文庫構建中間產物單鏈序列。

8.一種宏基因組測序文庫，其特征在于，所述宏基因組測序文庫根據權利要求5-7任一項所述的方法獲得的。