[發明專利]細胞穿膜肽hPP10的生產及其介導質粒DNA轉染的方法

有效

• 申請號: 201210267005.1
• 申請日: 2012-07-30
• 公開（公告）號: CN102863516A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 柳長柏;馬節蘭;蔡三金;吳江鋒;張潔;賀曉敏;楊英桂
• 申請（專利權）人: 三峽大學
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K1/06;C07K1/04;C12N15/12;C12N15/70;C12N15/63
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 向華

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，具體講，涉及一種新型人源性細胞穿膜肽hPP10的生產及其介導質粒DNA轉染的方法。

背景技術

隨著人類基因組計劃的完成和蛋白質組學的興起，人們發現越來越多的生物分子比如蛋白質、多肽、核酸等均有可能成為治療藥物。但是與傳統藥物不同的是，這些治療分子在體內穩定性低、需要在胞內發揮功能的分子難以進入細胞，因而會限制其作為藥物的推廣應用。故開發能有效攜帶這些治療性生物大分子進入靶細胞、經濟、安全的載體系統是亟需解決的問題。

近年來，非病毒藥物運輸載體以其安全性、低毒性、低免疫反應等優點被寄予厚望。迄今比較常用的生物大分子細胞內導入方式有如電穿孔、脂質體轉染和有機高分子納米顆粒等可能存在著安全隱患如對細胞的毒性作用、胞內釋放困難、難于組裝及操作和用于體內等這樣那樣的缺點。因此尋找新型的理想的非病毒藥物輸送系統引起了學者們的廣泛興趣（圖18）。

在過去的20多年間，將核酸、多肽、蛋白等具有治療作用的生物活性大分子跨膜轉運入細胞內的技術取得了突破性進展。國內外學者在對一些病毒感染特性的研究中相繼發現了一類蛋白結構域，如：HIV-1?Tat（48～60）、VP22?(267～300)，以及果蠅蛋白ANTP（43～58）等具有介導異源蛋白、寡聚核酸、金屬螯合物等生物活性大分子直接跨過細胞膜進入胞漿和核內的功能，這一類富含陽離子、具有穿膜功能的短肽被稱之為細胞膜穿透肽（cell-penetrating?peptides，CPPs）、穿膜肽或蛋白轉導域（proteintransduction?domains，PTDs）。1988年Green和Frankel等首次發現TAT——人免疫缺陷病毒（HIV）的轉錄調節蛋白可以穿透細胞膜/核膜進入細胞漿/細胞核，隨后的研究發現，該蛋白第48-60位氨基酸殘基（YGRKKRRQRRR）形成的肽段即可完全發揮其穿膜功能。以后又相繼發現了多個源自病毒或其他生物的CPP，如I型單純皰疹病毒（herpes?simplex?virus?type?1,HSV-1）蛋白的VP22、果蠅同源觸角蛋白（drosophila?hemeoprotein?antennapedia?transcription?protein,ANTP）、乙型肝炎病毒（Hepatitis?B?virus，HBV）的前S抗原等。依據其來源不同可將已經發現的CPP大致分為兩類：一類為如上面提及的TAT、VP22、ANTP和前S抗原來源于病毒的短肽等；另一類為根據天然CPPs的特點人工合成的短肽如多聚精氨酸、MPG、PEP-1、MAP、transportan和各種基于不同信號序列合成的肽段等。CPPs能在體外或體內作為載藥多肽，介導一系列生物活性分子如DNA、siRNA、多肽、蛋白質甚至納米顆粒等進入細胞，發揮各自的生物學效應。這些CPPs因基本無毒副作用、不干擾所攜帶生物大分子活性，而被廣泛用于體外或/和體內向細胞內運送生物活性分子，尤其是在抗腫瘤治療的應用研究方面更是引人注目。CPPs研究在基礎生物學和應用研究上都具有極大意義，作為一種有效的胞內運載工具，有著廣泛的應用前景（圖19）。

然而來源于病毒或其他種屬生物蛋白結構域的CPP，在臨床應用上可能仍然存在一定的安全隱患，比如可能的細胞毒性和免疫原性問題。人們對TAT作為CPP進行了大量研究，腹腔注射Tat-β-半乳糖苷酶，能進入小鼠各種臟器組織，甚至可以透過血腦屏障進入腦組織。但由于TAT源于HIV病毒蛋白而恐存有安全憂患，一直未能用于臨床研究。另有報道稱，應用TAT攜帶藥物的上呼吸道噴霧引發了嚴重的肺部病理反應。可見，針對不同治療需要，開發更為安全的、新型穿膜肽－－人源性穿膜肽（hCPP）是非常必要的。

2002年，Beck-Sickinger?AG小組開創性地發現了第一個人源性穿膜肽－來源于人降血鈣素（hCT）的第9-32的殘基。隨后相繼報道的人源性穿膜肽還有來自于hCLOCK蛋白（一種與生物節律調節有關的蛋白，2004年）、Hph-1(一種人源轉錄因子，2006年)、Bag-1蛋白（一種可與Bcl-2相互作用的激活糖皮質激素受體的蛋白，2006年）、p14ARF蛋白（一種人抑癌基因蛋白，2008年）、人乳鐵蛋白（2009年）、人Cytc77-101及Cytc86-101（2010年）和TCTP蛋白（來源于人翻譯控制腫瘤蛋白氨基末端10個氨基酸殘基，2011年）的CPPs。與其他生物來源的CPPs相比，人源性CPPs引起人體的免疫反應的可能性比較小，潛在的不安全因素相對較少。因此，作為臨床應用的藥物分子載體有著更廣闊的應用前景。