[發(fā)明專(zhuān)利]細(xì)胞穿膜肽hPP10的生產(chǎn)及其介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210267005.1
• 申請(qǐng)日: 2012-07-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102863516A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柳長(zhǎng)柏;馬節(jié)蘭;蔡三金;吳江鋒;張潔;賀曉敏;楊英桂
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 三峽大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K7/08
• 分類(lèi)號(hào): C07K7/08;C07K1/06;C07K1/04;C12N15/12;C12N15/70;C12N15/63
• 代理公司: 北京君智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11305
• 代理人: 向華

1.一種新型人源性細(xì)胞穿膜肽hPP10的化學(xué)合成方法，包括以下步驟：

（1）用Fmoc基團(tuán)對(duì)α-氨基進(jìn)行保護(hù)的賴氨酸通過(guò)一個(gè)支臂連結(jié)到不溶性載體樹(shù)脂上；

（2）用TFA(三氟乙酸)溶液洗滌賴氨酸―支臂―樹(shù)脂，使α-氨基脫保護(hù)；

（3）將第二個(gè)預(yù)先用適當(dāng)?shù)目s合劑DCC活化的α-氨基保護(hù)的異亮氨酸通過(guò)耦聯(lián)反應(yīng)與賴氨酸形成共酯連接上去；

（4）用TFA溶液洗滌異亮氨酸―支臂―樹(shù)脂，使α-氨基脫保護(hù)；

（5）將第三個(gè)預(yù)先用適當(dāng)?shù)目s合劑DCC活化的α-氨基保護(hù)的脯氨酸通過(guò)耦聯(lián)反應(yīng)與異亮氨酸形成共酯連接上去；重復(fù)進(jìn)行上述脫保護(hù)、耦聯(lián)，直到耦合上最后一個(gè)氨基酸精氨酸，脫去Fmoc保護(hù)基團(tuán)，合成完成；

（6）將切割試劑加入到肽-樹(shù)脂中，把肽鏈從樹(shù)脂上切割下來(lái)，同時(shí)也將各個(gè)氨基酸上的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)從肽鏈上切割下來(lái)，加入乙醚，沉淀多肽，獲得多肽粗品；

（7）運(yùn)用HPLC/MS進(jìn)行多肽的鑒定和純化，最終得到所需多肽。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述樹(shù)脂是羧基樹(shù)脂（Fmoc-Tyr(tBu)-Wang?resin），合成方法為Fmoc固相合成法。

3.一種新型人源性細(xì)胞穿膜肽hPP10的基因工程表達(dá)法，采用原核表達(dá)方法，包括以下步驟：

（1）設(shè)計(jì)編碼hPP10的兩條單鏈cDNA，兩側(cè)帶有NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)，合成單鏈寡聚核苷酸鏈，再將兩條單鏈DNA等量加入水溶液中，經(jīng)95℃，5分鐘，自然冷卻至室溫使其完成退火，形成互補(bǔ)的雙鏈DNA片段（hPP10）；

（2）利用NdeI/XhoI兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，37℃溫育兩小時(shí)，將表達(dá)質(zhì)粒pET15b線性化；

（3）進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射儀的長(zhǎng)波紫外光照射下，切膠回收含線性化質(zhì)粒pET15b的條帶；瞬時(shí)離心，將凝膠集中至管底，依切膠回收試劑盒內(nèi)的操作說(shuō)明完成切膠回收；

（4）將回收、純化的線性化質(zhì)粒DNA片段和退火后的穿膜肽cDNA片段（hPP10）分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定連接比例，將混合連接體系置于16℃水浴箱中溫育過(guò)夜連接；

（5）CaCl₂法制備DH5ａ感受態(tài)細(xì)胞，運(yùn)用熱休克法以上述連接產(chǎn)物pET15b-hPP10轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)0.1g/L氨芐青霉素瓊脂平板37℃過(guò)夜篩選后，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；

（6）離心沉淀收集擴(kuò)增轉(zhuǎn)化細(xì)菌，用堿裂解法提取重組質(zhì)粒，篩選成功構(gòu)建的陽(yáng)性克隆pET15b-hPP10，酶切并測(cè)序驗(yàn)證；

（7）將驗(yàn)證正確的重組原核質(zhì)粒pET15b-hPP10轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)菌；經(jīng)0.1g/L氨芐青霉素瓊脂平板37℃過(guò)夜；

（8）挑取單克隆菌落接種于含氨芐青霉素LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；

（9）用15ml無(wú)菌離心管裝3.8ml?Amp(+)LB液體培養(yǎng)基，接種0.2ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液（1:20），37℃，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)3h；

（10）于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌培養(yǎng)物中加入40μl?0.1M?IPTG至終濃度1.0mM，37℃，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)；

（11）于加入IPTG后6h取樣200μl菌懸液；

（12）離心收菌體集沉淀，用等體積1×Sample?Buffer重懸，沸水浴5min，制備全蛋白裂解液；

（13）上樣，SDS-PAGE檢測(cè)、鑒定目的肽hPP10表達(dá)情況。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述SDS-PAGE分析所表達(dá)和純化的融合肽（hPP10帶有6x組氨酸標(biāo)簽），表明可以通過(guò)基因工程細(xì)菌表達(dá)和通過(guò)鎳柱純化得到純的hPP10-6xHis融合肽。