[發明專利]一種近紅外的電致化學發光免疫檢測方法

有效

• 申請號: 201210262285.7
• 申請日: 2012-07-26
• 公開（公告）號: CN102749452A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 鄒桂征;劉淑風;梁國棟
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531;G01N21/76
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 王緒銀

技術領域：

本發明涉及一種近紅外的電致化學發光免疫檢測方法，特別涉及一種以近紅外碲化鎘（CdTe）量子點為標記物的電致化學發光免疫檢測方法，屬于電致化學發光免疫檢測技術領域。

背景技術：

近紅外光具有組織穿透性好、背景干擾低以及光學損傷小等優點，因此近紅外分析技術在生命分析科學領域具有廣闊的應用前景，新型近紅外發光體和相關傳感策略的構建也隨之變得意義深遠；電致化學發光(Electrochemiluminescence，ECL)分析無需激發光源、信噪比高而且具有比常規熒光分析法更高的靈敏度，是一種已在多個研究領域獲得廣泛應用的分析技術；但是由于傳統ECL物質的電化學發光輻射都在可見光區域，如魯米諾和[Ru(bpy)₃]²⁺(bpy=2,2′-bipyridyine)等，因此ECL分析技術的傳感應用一直局限在可見光區域。

伴隨著納米制備技術的進步，近紅外量子點在開發新型近紅外ECL發光體顯出巨大潛力；然而，目前近紅外量子點ECL的研究主要在陰極進行，在陽極卻難有突破，而且其ECL激發電位較高并且在實際應用中難以克服復雜電化學反應和生物組織中溶解氧的干擾；同時，現有技術中采用的量子點近紅外ECL輻射集中在700nm附近，無法有效消除生物組織的背景干擾(Jing?Wang,Heyou?Han,Xiaochun?Jiang,Liang?Huang,Lina?Chen,and?Na?Li?Anal.Chem.,2012,84(11),4893–4899)；因此，尋求能夠克服復雜電化學反應和生物組織背景干擾的電致化學發光免疫檢測方法已成為業界不斷追求的目標。

發明內容：

針對現有技術的不足，本發明提供一種近紅外的電致化學發光免疫檢測方法。

術語說明：

表面帶有羧基的碲化鎘量子點：根據已公開專利文獻中描述的方法得到，該專利文獻的公開號為CN101870459A；

抗原：本發明所述的抗原指：甲胎蛋白抗原，癌胚抗原，糖類抗原125，糖類抗原15-3，糖類抗原72-4，糖類抗原19-9，前列腺特異性抗原，游離前列腺特異抗原，愛滋病抗原，乙肝表面抗原，乙肝e抗原，甲狀腺球蛋白，肌鈣蛋白T抗原，肌紅蛋白抗原等常規的抗原。

一抗：本發明所述的一抗指：對上述抗原對應產生的抗體，本發明對于上述抗原對應的單克隆抗體效果更好。

二抗：本發明所述的二抗指：對上述抗原和一抗對應產生的二抗。

處理過的病人血清樣品：指按照醫學領域通用的血清處理標準處理后的病人血清樣品；

本發明的技術方案如下：

一種近紅外的電致化學發光免疫檢測方法，包括步驟（1）近紅外量子點與二抗的連接、步驟（2）夾心免疫反應并制得電致化學發光免疫傳感器和步驟（3）用電致化學發光免疫傳感器進行免疫檢測：

（1）近紅外量子點與二抗的連接：

將表面帶有羧基的量子點作為標記物并分散到含有1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺的緩沖溶液中，加入二抗，漩渦混合震蕩均勻，在室溫下反應，對反應溶液進行離心，并用上述緩沖溶液洗滌2-5次，得量子點標記的二抗；

（2）夾心免疫反應：

首先，將表面枝接有羧基的固體電極在含有1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的緩沖溶液中活化后，取含有一抗的緩沖溶液滴加到電極表面，在30-50℃下孵育1-6h，將一抗固定在電極上，并采用3%體積濃度的牛血清白蛋白滴加到電極封閉非特異性吸附的活性位點；其次，取含有不同濃度待測抗原(antigen，Ag)的緩沖溶液或處理過的病人血清樣品滴涂到電極上，在35-45℃下孵育1-6h，清洗電極；最后，取量子點標記的二抗溶液滴加到上述電極上，在35-45℃下孵育1-6h，制得近紅外電致化學發光免疫傳感器，所選緩沖溶液因抗原、抗體種類而異，標準是使免疫反應的活性最大，電致化學發光輻射最強；

（3）用電致化學發光免疫傳感器進行免疫檢測：

將上述近紅外電致化學發光免疫傳感器清洗后，在含有10-100mmol/L2-N-二丁氨基乙醇或三丙胺的緩沖溶液中進行電致化學發光測試；先利用夾心免疫分析方法，測定一系列標準濃度抗原的電致化學發光信號，然后確定抗原標準工作曲線，最后利用標準曲線法測定待測樣品中抗原的濃度。