[發明專利]肺炎支原體耐藥菌株的PCR-SNP檢測方法

有效

• 申請號: 201210262158.7
• 申請日: 2012-07-26
• 公開（公告）號: CN102747166A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 孫紅妹;李少麗;薛冠華;趙漢青;馮燕玲
• 申請（專利權）人: 首都兒科研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/35
• 代理公司: 北京中偉智信專利商標代理事務所 11325
• 代理人: 張岱

技術領域

本發明屬于生物、醫藥領域，具體地涉及一種肺炎支原體耐藥菌株的PCR-SNP檢測方法。

背景技術

肺炎支原體(Mycoplasma?pneumoniae，Mp)是社區獲得性呼吸道感染的重要致病菌之一，其感染后的臨床表現可以從輕度的咽喉炎、支氣管炎到重癥間質性肺炎(原發性非典型肺炎)及神經系統、心血管系統并發癥等。Mp流行具有周期性，每3-7年在不同地區出現發病率高峰。兒童肺炎中10-30％的病例是Mp引起的，在流行高峰年Mp肺炎可高達30-50％，且流行可持續1-2年。進入21世紀以來，全球性的Mp感染暴發流行已出現了兩次，分別在2005-2007年和2010-2012年初發生。Mp感染暴發流行對家庭、學校、部隊、社會都會產生較大的經濟損失和社會不良影響。

肺炎支原體無細胞壁，是目前已知的能在無生命培養基中生長繁殖的最小的原核細胞型微生物，其對青霉素等作用于細胞壁的抗生素天然耐藥。能用于治療支原體肺炎的藥物目前僅有大環內酯類、喹諾酮類、氨基糖甙類、四環素類等藥物，由于大部分藥物對兒童正常生長發育有副作用，目前大環內酯類抗生素是治療兒童支原體感染的首選藥物。以往的研究表明，及時采用適當的抗生素可預防、治療肺炎支原體感染導致的肺炎，能夠縮短暴發流行的過程。但是，隨著大環內酯類藥物在臨床上的廣泛應用，其耐藥現象也不斷出現，并呈逐漸增加趨勢。近年來，已有美國、日本、法國、德國、芬蘭等多個國家報道了MP耐藥株的出現，我國則有更多耐藥株出現的報道，造成治療用的抗生素失效。

目前，大量的研究資料表明，肺炎支原體耐大環內酯類藥物的機制主要為基因突變，其中23S?rRNA基因區部分的基因突變是其對大環內酯類藥物耐藥的主要原因之一。這些位點主要集中在2063、2064和2617等。而目前國內外用于Mp耐藥性檢測的方法主要有：對PCR產物的直接測序法，毛細管電泳法，限制性片段長度多態性，熒光定量PCR等。雖然這些方法比較可靠，但均存在費時和工作量大等問題，應用于大規模的臨床檢測服務還有待探討。理想的Mp耐藥突變檢測方法應該是不需復雜的設備、操作簡單、花費低、不需使用有害試劑或同位素、高效率、耗時短等。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種肺炎支原體耐藥菌株的PCR-SNP檢測方法，通過設計3條引物可一次性檢測出肺炎支原體的任一耐藥突變位點，以解決目前肺炎支原體耐藥性檢測方法中費時、費力且不能在臨床上大規模檢測標本的問題。

本發明是通過以下技術方案實現的：

(1)一種肺炎支原體耐藥菌株的PCR-SNP檢測方法，具體包括以下步驟：

根據已知的Mp23S?rRNA中的耐藥突變基因位點(2063、2064、2611、2616、2617等)設計1條上游引物、1條下游引物和1條特異性引物對其進行特異性擴增，特異性引物是人為在引物的3′端引入一個錯配堿基且3′端末端落在突變位點；

(2)提取待測樣本DNA；

(3)利用上述3條引物、樣本DNA及其它PCR組份構建PCR反應體系并進行擴增；

(4)對上述PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，判定是否發生耐藥基因突變。

進一步，所述的步驟(1)中的3條引物為F：5’AGAAGGAGGTTAGCGCAAGCG3’，S：5’TATATTAGGCGCAACGGGACAGA?3’，R：5’CTGGATAACAGTTACCAATTAGAACAGC?3’。

進一步，所述的步驟(3)中的PCR反應體系為25μl：10×PCR?reaction?buffer2.5μl，MgCl₂(25mM)2μl，dNTPs(2.5mM)2μl，上游引物F(10μM)1.0μl，下游引物R(10μM)1.0μl，特異性引物S(10μM)1.5μl，Taq?DNA?polymerase(2.5U)1μl，DNA模板3μl、雙蒸水11μl。

進一步，所述的步驟(3)中的PCR擴增條件為預變性94℃10min，接著94℃0.5min，58℃0.5min，72℃1min，30個循環，最后72℃延伸10min。