[發明專利]基于耐熱核酸酶HII的單核苷酸多態性檢測方法

無效

• 申請號: 201210260940.5
• 申請日: 2012-07-25
• 公開（公告）號: CN103571932A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 李玉占
• 申請（專利權）人: 上海賽弗生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 曾少麗

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，特別是指一種基于耐熱核酸酶HII的單核苷酸多態性檢測方法。

背景技術

核酸檢測和SNP分析已經是一個很大的產業。這些技術不僅在科學研究上獲得廣泛的應用，在臨床診斷、食品檢測、法醫鑒定等領域的重要性也越來越明顯。現今的核酸檢測和SNP分析技術種類多樣，其基本核心是核酸雜交檢測技術、核酸序列分析技術和聚合酶鏈式反應(PCR)。檢測通量與靈敏度高，以及操作簡單、檢測時間短是基因和SNP檢測的發展方向。

分子信標（molecular?beacon）為DNA的恒溫檢測提供了可能,已成功用于檢測多種致病微生物。分子信標是一種短的寡核苷酸單鏈構成的莖環結構。寡核苷酸鏈一端為熒光基團標記，另一端為淬滅基團標記。由于兩端的核苷酸序列互補，其熒光基團和淬滅基團相互靠近發生能量共振，被激發后熒光基團產生的光子被淬滅基團淬滅。如果被檢測的核酸分子能夠與分子信標的單鏈環區域雜交，分子信標的莖結構遭到破壞，增加了熒光基團與淬滅基團之間的空間距離，不能產生熒光能量共振轉移，就能夠檢測被激發后熒光基團產生的熒光信號。但是在整個檢測過程中，熒光信號的強弱依賴于被檢測的DNA分子的含量，不存在信號放大，因此直接用分子信標雜交目標核酸的檢測技術，其靈敏度不理想。

RNase?HII是一種核糖核酸內切酶，它能夠特異性地水解雜交到DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵，能分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈。該酶不能消化單鏈或雙鏈DNA。J.Rizzo等人在2002年首次運用分子信標方法來檢測核糖核酸酶動力學和酶切機制[Molecular?and?Cellular?Probes,2002,16:277–283]。但是目前為止未見關于核糖核酸酶HII結合分子信標來檢測核酸分子的方法。

發明內容

本發明針對現有技術的缺陷，提出一種基于耐熱核酸酶HII的單核苷酸多態性檢測方法，該檢測方法可以檢測雙鏈核酸并放大檢測信號，靈敏度較高。

本發明的技術方案是這樣實現的：

一種基于耐熱核酸酶HII的單核苷酸多態性檢測方法，使用耐熱核酸酶HII（）切斷帶有核糖核苷酸的分子信標，將熒光信號積累下來，檢測雙鏈DNA；其中，所述帶有核糖核苷酸的分子信標為中間帶有一個核糖核酸，兩側的核苷酸彼此配對，兩側分別用熒光發射基團和熒光淬滅基團標記，整個分子信標形成莖環結構，無熒光釋放出來。分子信標中間帶有核糖核苷酸，耐熱核酸酶HII可以切斷分子信標，放大熒光信號。核酸酶HII來源于耐熱微生物，因此檢測反應可以在高溫下以熱循環的形式進行，可以有效的檢測雙鏈DNA樣本。

作為優選的技術方案，所述的檢測方法還包括與PCR擴增偶聯，檢測反應與核酸擴增反應耦合在一起，提高了檢測靈敏度。

作為優選的技術方案，所述的分子信標長33個核苷酸，中間帶有一個核糖核苷酸，中間的21個核苷酸與檢測樣本DNA配對，兩側的6個核苷酸彼此配對。

作為優選的技術方案，所述的熒光發射基團可以用FAM，TET等；所述的熒光淬滅基團可以用DACBYL等。

作為優選的技術方案，所述分子信標為

Amp-T：

5’FAM-CGCGCCAGTAAGGGAAruAGGAAGTACTGGCGCG-DABCYL、

Amp-A：

5’FAM-CGCGCCAGTAAGGGAAraAGGAAGTACTGGCGCG-DABCYL、

Amp-C：

5’FAM-CGCGCCAGTAAGGGAArcAGGAAGTACTGGCGCG-DABCYL、或

Amp-G：

5’FAM-CGCGCCAGTAAGGGAArgAGGAAGTACTGGCGCG-DABCYL。

作為優選的技術方案，所述檢測方法具體包括：

步驟Ⅰ，制備中間帶一個核糖核苷酸的分子信標；

步驟Ⅱ，檢測反應體系的建立；

將擴增目標DNA的引物序列、dNTP、Taq?DNA聚合酶、Tth核酸酶HII、分子信標和檢測樣本DNA加入Taq酶催化的反應體系中，配制反應混合物；

步驟Ⅲ，熒光信號放大反應；

將步驟Ⅱ中的反應混合物，放入熒光定量PCR儀中，進行PCR擴增和基因分型檢測；

步驟Ⅳ，確定基因多態性；

根據不同樣本間熒光信號的差異，確定檢測樣本待測位點的單核苷酸多態性。