[發(fā)明專利]一種高活性復(fù)合纖維素酶及其制備和在木質(zhì)纖維酶解糖化中的應(yīng)用方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210260079.2
• 申請日: 2012-07-20
• 公開（公告）號: CN102787104A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳介南;詹鵬;張林;王義強;陳石蘭
• 申請（專利權(quán)）人: 中南林業(yè)科技大學(xué);長沙聯(lián)美生物科技有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N9/42;C12P19/14;C12R1/645
• 代理公司: 長沙市融智專利事務(wù)所 43114
• 代理人: 袁靖

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種真菌高產(chǎn)纖維素酶制備的復(fù)合酶及其制備方法，以及它在木質(zhì)纖維酶解糖化中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

由于能緩解能源緊張、減少環(huán)境污染、促進農(nóng)村發(fā)展、避免“與人爭糧，與農(nóng)爭地”等重要作用，利用自然界豐富的木質(zhì)纖維素植物資源生產(chǎn)燃料乙醇已越來越受到社會的關(guān)注和支持，纖維素燃料乙醇已經(jīng)成了可再生能源的重要組成部分。從木質(zhì)纖維素到乙醇的生物轉(zhuǎn)化過程通常包括：①木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理；②纖維素酶的生產(chǎn)；③纖維素的水解糖化；④纖維素水解產(chǎn)物（己糖）的發(fā)酵和⑤半纖維素水解產(chǎn)物（戊糖）的發(fā)酵。

纖維素乙醇生產(chǎn)過程中，纖維素酶的成本占了很大的比例，甚至達到了整個成本的一半以上。纖維素酶是利用產(chǎn)纖維素酶的菌株經(jīng)過發(fā)酵提取精制而成的液體狀復(fù)合酶制劑，包括內(nèi)切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三種酶系。目前，里氏木霉是公認的一種優(yōu)秀的產(chǎn)纖維素酶的菌種，但其產(chǎn)生的纖維素酶中的β-葡萄糖苷酶活性較低，致使纖維二糖積累，影響了酶解糖化效率，進而降低了乙醇的得率。進行高活性纖維素酶制取及酶系優(yōu)化在木質(zhì)纖維酶解糖化中的應(yīng)用對木質(zhì)纖維燃料乙醇生產(chǎn)具有重要的實踐價值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是客服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種由爪哇正青霉高產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶制備的高活性復(fù)合纖維素酶及其制備方法，并進行復(fù)合酶系優(yōu)化實現(xiàn)其在酶解糖化木質(zhì)纖維中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過以下方式實現(xiàn)的：

一種高活性復(fù)合纖維素酶：所述的復(fù)合纖維素酶是由爪哇正青霉ZN-205?CCTCC?NO:M208204生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶與里氏木霉Rut?C-30?ATCC?56765生產(chǎn)的纖維素酶（里氏木霉Rut?C-30?ATCC?56765生產(chǎn)纖維素酶的方法見參考文獻1）經(jīng)濃縮處理，將濃縮后的酶液進行混合得到的，得到的復(fù)合纖維素酶的β-葡萄糖苷酶活/PFA酶活最優(yōu)比值為1.4；

所述的爪哇正青霉ZN-205?CCTCC?NO:M208204生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的過程如下：

挑取一環(huán)爪哇正青霉ZN-205?CCTCC?NO:M208204孢子接種于種子培養(yǎng)基的搖瓶中，搖床上培養(yǎng)作為接種物；按搖瓶裝液量體積的5%，將上述接種物接種于裝有100ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，28℃，175rpm條件下培養(yǎng)5天；離心，上清液即為β-葡萄糖苷酶；

所述的爪哇正青霉ZN-205?CCTCC?NO:M208204產(chǎn)酶培養(yǎng)基：初始pH為6.0；微晶纖維素質(zhì)量濃度為2.5%，蛋白胨質(zhì)量濃度0.75%，KH₂PO₄?2g/L，CaCl₂·2H₂O?0.4g/L，MgSO₄·7H₂O?0.02g/L，Mandels微量元素濃縮液1ml/L，1mol/L檸檬酸緩沖液50ml/L；吐溫-80的添加質(zhì)量百分比為0.05%，加水配制成1L；

其中，Mandels微量元素濃縮液：FeSO₄·7H₂O?5g/L，MnSO₄·H₂O?1.6g/L，ZnSO₄·7H₂O?1.4g/L，CoCl₂·6H₂O?3.7g/l，加水配制成1L；

1mol/l檸檬酸緩沖液：檸檬酸(C₆H₈O₇·H₂O?210g)，H₂O?750ml，加NaOH?78g，冷卻后測pH為4.2，加水至1000ml，pH為4.45。

所述的爪哇正青霉ZN-205?CCTCC?NO:M208204種子培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨1g/L，Mandels營養(yǎng)鹽濃縮液100ml/L，Mandels微量元素濃縮液1ml/L，1M檸檬酸緩沖液50ml/L，加水配制成1L；