[發明專利]一種快速檢測灰霉病菌對殺菌劑敏感性的方法

無效

• 申請號: 201210259733.8
• 申請日: 2012-07-25
• 公開（公告）號: CN102759513A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發明（設計）人: 劉峰;幕衛;楊曉楠
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N33/543
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

（一）技術領域

本發明涉及殺菌劑室內毒力測定技術，具體是基于微孔板法對殺菌劑對灰霉病菌的抑制效果進行快速、準確測定的方法。

（二）技術背景

灰霉病Botrytis?cinerea是寄主范圍很廣的世界性病害，在番茄、黃瓜等設施蔬菜上危害尤為嚴重，生產上灰霉病主要以化學防治為主。但番茄灰霉病菌是一種較易產生抗藥性的高風險真菌，其對不同殺菌劑的抗性發展在國內外已經被頻繁報道，及時進行快速高效的敏感性檢測是灰霉病菌抗藥性治理的必要程序。另外，由于新殺菌劑開發成功機率的降低以及合成能力迅速提高，利用室內生測方法對新化合物的抑菌效果進行高通量篩選已成為新農藥創制過程中的必經環節。傳統的殺菌劑室內生測方法為孢子萌發法和菌絲生長速率法，前者計數困難，后者測試時間較長（72h）、工作量大，兩者很難作為快速進行敏感性檢測和高通量篩選殺菌劑的方法。尋找快速、準確和易于操作的生測方法成為國內外病菌敏感性檢測和殺菌劑高通量篩選的目標。

微孔板法（Microtiter?method）是利用酶標儀的比色功能快速檢測微孔板（96孔板）中懸浮液的OD值，以OD增加值作為評價指標，用空白對照組與藥劑處理組OD增加值的差值來計算藥劑抑制率的方法。該方法在殺細菌劑篩選中應用較多，但在殺真菌劑中報道較少。G.Stammler（2006）曾用YBA培養液制得2×10⁴個/ml的孢子懸浮液，利用微孔板法測定了啶酰菌胺對灰霉病菌孢子萌發及菌絲生長的綜合抑制效果，由于孔中懸浮液OD值增加緩慢，測試時間長達5d；張曉等（2010）建立了番茄早疫病菌Alternaria?solania的高通量定量篩選方法，并對常用殺菌劑的抑菌效果進行了評價，但是該方法只能檢測藥劑對番茄早疫病菌孢子萌發及菌絲生長的綜合抑制效果，在只檢測孢子萌發抑制率時則OD增加值過小，由于酶標儀本身有一定的測量誤差，OD增加值過小容易導致測試結果的重復性差。

（三）發明內容

本發明以番茄灰霉病菌B.cinerea為對象，以已有研究方法為基礎，通過對試驗條件進行優化盡量增加了孔中懸浮液OD增加值，并通過與傳統生測方法的比較確定了合適的測量時間，目的在于確定一種快速、準確的殺菌劑室內生測方法，使其能夠用于分別測定殺菌劑對灰霉病菌孢子萌發和菌絲生長的抑制效果。

1）測定殺菌劑對灰霉病菌孢子萌發抑制率以及對孢子萌發和菌絲生長綜合抑制率的方法步驟為：

將用PDE培養基洗脫、過濾獲得的孢子懸浮液加入到96孔板中，再加入經稀釋過的待測藥劑，獲得相應的藥劑質量濃度，并設置空白對照組。用封口膜將96孔板密封嚴實，于酶標儀上測定OD值(對照0h吸光度值為OD₀，各處理0h吸光度值為OD₁)。于21℃黑暗條件下振蕩（150r/min）培養，分別于24h、36h時再測定OD值，按照公式(1)計算藥劑對分生孢子萌發的抑制率（24h時）及對孢子萌發和菌絲生長的綜合抑制率（36h時）。

2）測定殺菌劑對灰霉病菌菌絲生長抑制率的方法步驟為：

將用PDE培養基洗脫、過濾獲得的孢子懸浮液加入到96孔板中，將其于21℃黑暗條件下振蕩（150r/min）培養12h后，再加入經稀釋過的藥劑，獲得相應的待測藥劑質量濃度，設置空白對照組。用封口膜將96孔板密封嚴實，于酶標儀上測定OD值(對照0h吸光度值為OD₂，各處理0h吸光度值為OD₃)。于21℃黑暗條件下振蕩（150r/min）再培養，于12-24h后再測定OD值。按照公式（2）計算藥劑對菌絲生長的抑制率。

所述的PDE培養基，其配置方法為：馬鈴薯200g，沸水煮30分鐘后過濾得到濾液，向濾液中加入葡萄糖20g，加去離子水至1L，經滅菌后每升加入激動素0.01g，赤霉素0.05g，維生素B2?0.15g，FeCl₃?0.15g，CaCl₂?0.2g，鏈霉素（50μg/mL）且用1mol/L?NaOH調節至pH值4.5。

所述孢子懸浮液孢子濃度為8×10⁵～1.6×10⁶個/mL，96孔板中每孔加入的孢子懸浮液和藥劑的量分別為180μL和20μL。

所述酶標儀測定波長為630nm。

本發明的有益效果是：

1）本發明通過對試驗條件的優化，提高了孢子懸浮液OD值增加速度，基本滿足了快速測定的要求。