[發明專利]一種用于篩選和評價抗腸道病毒71型藥物的融合蛋白及其應用

無效

• 申請號: 201210255495.3
• 申請日: 2012-07-23
• 公開（公告）號: CN102766607A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 鐘照華;林樂勛;郭志偉;佟雷;趙文然
• 申請（專利權）人: 哈爾濱醫科大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/85;C12N15/66;C12N5/10;C12Q1/66;C12Q1/37;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;韓小雷

技術領域

本發明涉及一種用于篩選和評價藥物的融合蛋白及其應用，特別涉及一種基于化學發光方法篩選和評價抗EV71藥物的融合蛋白及其應用。屬于生物技術領域。

背景技術

腸病毒71型（enterovirus?71，EV71）是一種重要的神經感染性腸病毒，目前尚沒有有效地治療方法和疫苗。在亞太地區以及全世界范圍均有關于EV71病毒感染相關的傳染病爆發的報導（AbuBakar,S.,et?al..Enterovirus71?outbreak,Brunei.Emerg.Infect.Dis.2009，15:79–82.）。EV71感染主要會造成兒童的皮疹，被稱為手足口病（hand-foot-mouth?disease，HFMD）。然而，EV71急性感染還會造成嚴重的神經性疾病以及極高的死亡率。尤其是五歲以下兒童被EV71感染后會伴隨神經并發癥，包括無菌性腦膜炎、腦干和/或小腦腦炎，以及急性無力肢體麻痹、心肌炎和急性致死出血性肺水腫（Brown,B.A.,M.S.Oberste,J.P.Alexander,Jr.,M.L.Kennett,and?M.A.Pallansch.Molecular?epidemiology?and?evolution?of?enterovirus?71?strainsisolated?from?1970?to?1998.J.Virol.1999.73:9969-9975.）。

EV71屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬，是一種非包膜、單正鏈RNA病毒，基因組RNA包含約7400個核苷酸（nucleotide，nt）。其基因組結構由5’-UTR、3’-UTR、開放讀碼框（open?reading?frame，ORF）三部分構成。其中ORF分為P1、P2、P3三個部分，在翻譯的過程中，經過EV712A、3C蛋白酶的切割作用，P1編碼四個結構蛋白，VP1-VP4，P2編碼3個非結構蛋白（2A、2B、2C），P3編碼4個非結構蛋白（3A、3B、3C、3D）（Lin,J.Y,et?al..Viral?and?host?proteins?involved?in?picornavirus?life?cycle.J.Biomed.Sci.2009,16:103.）。EV713C蛋白酶的主要切割位點為病毒自身或者宿主細胞內Gln-Gly（Q/G）氨基酸的連接點（（Weng?KF,Li?ML,Hung?C?T,Shih?SR.Enterovirus?71?3C?protease?cleaves?a?novel?target?CstF-64?and?inhibits?cellular?polyadenylation.PLoS?Pathog.2009,5(9):1-13.）。

目前觀察和檢測EV71的方法除了傳統的病毒培養鑒定法外，主要是RT-PCR和免疫學方法，但這些方法操作上均比較復雜，且無法直接觀察到細胞或組織中病毒的變化情況，尤其是EV71在體內的感染情況，缺乏理想的評價體系，使得藥物抗EV71的作用效果難以作出評估，極大的延緩了藥物的研發和篩選，因而建立一種理想的抗EV71藥物的篩選評價體系迫在眉睫。

本發明的目的是針對現有技術的不足，提供通過化學發光觀察并檢測EV71感染情況的方法，可快速、有效、簡便地觀察并檢測到EV71的感染，為篩選抗EV71藥物提供了優良的平臺。

發明內容

本發明的目的在于通過EV713C蛋白酶對底物的切割，使重組融合蛋白中的Fluc的N段和C段緊密結合，使其在特異底物作用下發光，從而監測EV71的復制水平，進而提供了一種用于篩選和評價抗EV71藥物的融合蛋白。