[發明專利]一種用于篩選和評價抗腸道病毒71型藥物的融合蛋白及其應用

無效

• 申請號: 201210255495.3
• 申請日: 2012-07-23
• 公開（公告）號: CN102766607A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 鐘照華;林樂勛;郭志偉;佟雷;趙文然
• 申請（專利權）人: 哈爾濱醫科大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/85;C12N15/66;C12N5/10;C12Q1/66;C12Q1/37;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;韓小雷

1.一種用于篩選和評價抗腸道病毒71型藥物的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白含有以下（a）或（b）所示的氨基酸序列：

（a）SEQ?ID?No：1所示的氨基酸序列；或

（b）將SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或者添加仍具有評價EV713C蛋白酶活性作用的氨基酸序列。

2.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No：1所示。

3.編碼權利要求1或2所述的融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列含有以下（a）、（b）或（c）所示的核苷酸序列：

（a）SEQ?ID?No.2所示的核苷酸序列；或

（b）編碼SEQ?ID?No：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或

（c）與SEQ?ID?No.2所示的核苷酸序列具有90%以上同源性且其編碼的蛋白質具有評價EV713C蛋白酶活性作用的核苷酸序列。

4.如權利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQ?IDNo.2所示。

5.一種重組表達載體，其特征在于含有權利要求3或4所述的核苷酸序列。

6.如權利要求5所述的重組表達載體，其特征在于所述的重組表達載體為雙熒光報告載體，其由以下方法構建得到：

（1）將編碼熒光素酶的N段與C段的核苷酸序列分別與編碼兩個可緊密結合的小分子多肽pepA與pepB的核苷酸序列之一連接，得到的兩個片段由編碼EV713C蛋白酶作用底物的核苷酸片段相連，得到融合基因；

（2）將此融合基因插入真核表達載體pCDNA3.1(+)中，建立了可用于指示EV713C蛋白酶活性的表達載體；

（3）將N端和C端分別帶有巨細胞病毒（CMV）啟動子和猴空泡病毒40多聚腺苷酸尾（SV40polyA?tail）的綠色熒光蛋白（EGFP），稱為CMV-EGFP-SV40片段，反向插入步驟（2）得到的真核表達載體中，得到所述的雙熒光報告載體。

7.如權利要求6所述的重組表達載體，其特征在于所述的雙熒光報告載體為pANluc(△Q/G)BCluc-EGFP，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示。

8.一種宿主菌，其特征在于含有權利要求5-7任一項所述的重組表達載體。

9.權利要求1或2所述的融合蛋白在制備指示3C蛋白酶活性、指示EV71感染的水平的試劑或在篩選和評價抗腸道病毒71型藥物中的應用。

10.權利要求3或4所述的核苷酸序列在制備指示3C蛋白酶活性、指示EV71感染的水平的試劑或在篩選和評價抗腸道病毒71型藥物中的應用。