[發(fā)明專利]高活菌數(shù)光合細菌原代菌種的制種方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210255225.2
• 申請日: 2012-07-23
• 公開（公告）號: CN102747021A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蘇艷秋;羅國強;顧繼銳;白娟;翁云福;伍翠芳
• 申請（專利權(quán)）人: 通威股份有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/38
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)及生物制品領(lǐng)域，特別涉及一種高活菌數(shù)光合細菌原代菌種的制種方法。

背景技術(shù)

光合細菌（Photosynthetic?Bacteria?Abbr，簡稱PSB)是地球上出現(xiàn)最早、自然界中普遍存在、具有原始光能合成體系的原核生物，是在厭氧條件下進行不放氧光合作用的細菌的總稱，是一類沒有形成芽孢能力的革蘭氏陰性菌，是一類以光作為能源、能在厭氧光照或好氧黑暗條件下利用自然界中的有機物、硫化物、氨等作為供氫體兼碳源進行光合作用的微生物。光合細菌廣泛分布于自然界的土壤、水田、沼澤、湖泊、江海等處，主要分布于水生環(huán)境中光線能透射到的缺氧區(qū)。

目前已開發(fā)出多種光合細菌的制種方法和制種裝置，涉及到的專利有“一種用于規(guī)模生產(chǎn)高細胞濃度光合細菌的方法”（公開號CN101386820），“光合細菌制劑的制備方法”（公開號?CN1384188），“光合細菌制劑的制備方法”（公開號CN1400303），“一種制種光合細菌的方法”（公開號CN101358178），“一種濃縮光合細菌的制備方法”（公開號CN1861784），“光合細菌高效制備方法”（公開號CN1597925）。

從上述申請的專利可以看出，目前光合細菌生產(chǎn)企業(yè)及科研單位大多集中精力研究光合細菌的大規(guī)模生產(chǎn)，在擴繁環(huán)節(jié)煞費苦心，而對菌種本身沒有足夠重視，結(jié)果造成菌體活性降低、生長速度減慢、雜菌率增高，最終無法保證活菌數(shù)，影響使用效果。

術(shù)語解釋

光合細菌原代菌種：本發(fā)明中是指用于大規(guī)模生產(chǎn)用的菌種或?qū)嶒炇遗囵B(yǎng)出來的光合細菌菌種。

10倍梯度稀釋法：梯度稀釋法就是依次稀釋10倍，比如取1mL原液加入9mL水稀釋10倍，再從這里面取1mL與9mL水混和，依次類推，稱梯度稀釋。

雙層平板法：又叫雙層瓊脂平板法，先在培養(yǎng)皿中加入混有菌的底層固體培養(yǎng)基，待凝固后再加入半固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)一段時間后，觀察下層培養(yǎng)基中的菌落數(shù)。

菌落：將單個細菌細胞或一小堆同種細胞接種到固體培養(yǎng)基表面（或內(nèi)層），當它占有一定的發(fā)展空間并處于適宜的培養(yǎng)條件下時，該細胞就會迅速生長繁殖并形成細胞堆，即菌落。

單菌落：單菌落是指來源于單一孢子或營養(yǎng)細胞或一群相同的細胞在固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部形成的肉眼可見的集合體。

純菌落：菌種單一的菌落。與單菌落的區(qū)別在于單菌落可以是不同細胞集合在一起形成的菌落，而純菌落的話絕對是一個細胞生長繁殖形成的菌落，也稱為單克隆。

全價光合細菌培養(yǎng)基：全價光合細菌培養(yǎng)基是指營養(yǎng)價值全面，能滿足光合菌生長需求的配合式培養(yǎng)基。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述不足之處，本發(fā)明的目的之一就在于提供一種高活菌數(shù)光合細菌原代菌種的制種方法，該高活菌數(shù)光合細菌原代菌種的制種方法制種的光合細菌原代菌種生長迅速，培養(yǎng)3~5d后OD_660nm值即可達到1.5以上，雜菌率低，（＜5%），活菌數(shù)高（＞10^10~12cfu/ml）。

技術(shù)方案是：一種高活菌數(shù)光合細菌原代菌種的制種方法，該高活菌數(shù)光合細菌原代菌種的制種方法包括以下步驟：1)?菌種分離、純化；2)?種子篩選。

作為優(yōu)選，該高活菌數(shù)光合細菌原代菌種的制種方法還包括原代菌種保存步驟。

作為優(yōu)選，所述菌種分離、純化步驟包括以下分步驟：

①光合細菌菌液采用梯度稀釋法稀釋；

②稱取光合細菌雙層平板法下層培養(yǎng)基組分，加入0.2~0.6%瓊脂，加熱融化，冷卻至40~45℃；

③取適宜稀釋度稀釋液，按照稀釋液與培養(yǎng)基1:5~1:7比例，將稀釋液和培養(yǎng)基混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿，冷卻凝固；

④按照光合細菌雙層平板法，配制上層培養(yǎng)基，冷卻至室溫，注滿培養(yǎng)皿，加蓋，倒置，置于30~40℃，40~70W白熾燈光照條件下培養(yǎng)；

⑤待長出紅色單菌落后，去掉上層培養(yǎng)基，用接種環(huán)挑取單菌落，接入裝有無菌水的Ep管中打散，混勻。按照雙層平板法重復(fù)操作三次，獲得單克隆純菌落進行下一步操作。整個操作均在無菌超凈臺進行，保證無菌。

作為優(yōu)選，所述原代菌種保存為菌種保存于培養(yǎng)架上層，無陽光直射，保持散射光源，同時持續(xù)處于間隔20~40min自動持續(xù)攪拌1~5min。

作為優(yōu)選，所述種子篩選步驟包括以下分步驟：

①?培養(yǎng)基制備；

②?Ep管培養(yǎng)；

③?試管培養(yǎng)；

④?一級種子培養(yǎng)；