[發(fā)明專利]高活菌數(shù)光合細(xì)菌原代菌種的制種方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210255225.2
• 申請(qǐng)日: 2012-07-23
• 公開（公告）號(hào): CN102747021A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇艷秋;羅國(guó)強(qiáng);顧繼銳;白娟;翁云福;伍翠芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 通威股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12R1/38
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種高活菌數(shù)光合細(xì)菌原代菌種的制種方法，其特征在于該高活菌數(shù)光合細(xì)菌原代菌種的制種方法包括以下步驟：

1)?菌種分離、純化；

2)?種子篩選。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活菌數(shù)光合細(xì)菌原代菌種的制種方法，其特征還包括以下步驟：原代菌種保存。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高活菌數(shù)光合細(xì)菌原代菌種的制種方法，其特征在于所述菌種分離、純化步驟包括以下分步驟：

①光合細(xì)菌菌液采用梯度稀釋法稀釋；

②稱取光合細(xì)菌雙層平板法下層培養(yǎng)基組分，加入0.2~0.6%瓊脂，加熱融化，冷卻至40~45℃；

③按照稀釋液與培養(yǎng)基1:5~1:7比例，將稀釋液和培養(yǎng)基混勻，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿，冷卻凝固；

④按照光合細(xì)菌雙層平板法，配制上層培養(yǎng)基，冷卻至室溫，注滿培養(yǎng)皿，加蓋，倒置，置于30~40℃，40~70W白熾燈光照條件下培養(yǎng)；待長(zhǎng)出紅色單菌落后，去掉上層培養(yǎng)基，用接種環(huán)挑取單菌落，接入裝有無(wú)菌水的Ep管中打散，混勻；

⑤按照雙層平板法重復(fù)操作三次，獲得單克隆純菌落；

⑥整個(gè)操作均在無(wú)菌超凈臺(tái)進(jìn)行，保證無(wú)菌。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高活菌數(shù)光合細(xì)菌原代菌種的制種方法，其特征在于所述原代菌種保存為：菌種保存于培養(yǎng)架上層，無(wú)陽(yáng)光直射，保持散射光源，同時(shí)持續(xù)處于間隔20~40min自動(dòng)持續(xù)攪拌1~5min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高活菌數(shù)光合細(xì)菌原代菌種的制種方法，其特征在于所述種子篩選步驟包括以下分步驟：

①?培養(yǎng)基制備；

②?Ep管培養(yǎng)；

③?試管培養(yǎng)；

④?一級(jí)種子培養(yǎng)；

⑤?二級(jí)種子培養(yǎng)或擴(kuò)大培養(yǎng)；

⑥?三級(jí)種子培養(yǎng)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高活菌數(shù)光合細(xì)菌原代菌種的制種方法，其特征在于：

所述培養(yǎng)基制備為按比例稱量培養(yǎng)基配方各成分。

7.培養(yǎng)基配方為NaAc?2~5g/L、NH₄Cl?0.1~2g/L、NaHCO_3?0.4~3g/L、KH₂PO_4?0.01~1g/L、NaCl?0.5~3g/L、MgCl_2?0.05~2g/L、酵母膏0.1~2.5g/L。

8.其中除NH₄Cl和NaHCO₃外培養(yǎng)基成分100~121℃，滅菌15~30min；NH₄Cl和NaHCO₃配制成10倍母液，真空抽濾滅菌，以1:6~1:9添加到其余組分中制成無(wú)菌全價(jià)光合細(xì)菌培養(yǎng)基；

所述Ep管培養(yǎng)為去掉雙層平板中的上層培養(yǎng)基，挑取單克隆菌體轉(zhuǎn)接至含有無(wú)菌培養(yǎng)基的Ep管中，置于培養(yǎng)箱中30~40℃，40~70W白熾燈光照條件下培養(yǎng)，間隔2h~4h震蕩一次，防止菌體附壁影響生長(zhǎng)；從第4~7d開始淘汰長(zhǎng)勢(shì)不佳的菌體，保持淘汰率80~90%左右，以獲得最優(yōu)菌株；

所述試管培養(yǎng)為將Ep管中篩選得到的菌體轉(zhuǎn)接至無(wú)菌試管，加滿無(wú)菌培養(yǎng)基，密封管口；

所述一級(jí)種子培養(yǎng)為向無(wú)菌小型錐形瓶中加入無(wú)菌培養(yǎng)基，按照接種比例將試管培養(yǎng)篩選留下的菌體轉(zhuǎn)接進(jìn)去，瓶口密封；培養(yǎng)4~7d開始淘汰長(zhǎng)勢(shì)不佳的菌體，保持淘汰率80~90%左右，以獲得最優(yōu)菌株；

所述二級(jí)種子培養(yǎng)為向無(wú)菌中型錐形瓶中加入無(wú)菌培養(yǎng)基，按照接種比例將一級(jí)種子篩選留下的菌體轉(zhuǎn)接進(jìn)去，瓶口密封；培養(yǎng)4~7d開始淘汰長(zhǎng)勢(shì)不佳的菌體，保持淘汰率80~90%左右，以獲得最優(yōu)菌株；所述擴(kuò)大培養(yǎng)為將選出的二級(jí)菌種按比例接種至500mL錐形瓶進(jìn)行培養(yǎng)；

所述三級(jí)種子培養(yǎng)為按照1：10的比例，向裝有5L培養(yǎng)基的大型錐形瓶中加入500mL篩選出的二級(jí)種子；放入一顆經(jīng)過(guò)消毒處理的磁力轉(zhuǎn)子，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊；移上光合細(xì)菌原代菌種培養(yǎng)架，室溫，40~70W白熾燈光照下培養(yǎng)；培養(yǎng)架參數(shù)設(shè)置為間隔20~40min自動(dòng)持續(xù)攪拌1~5min，防止菌體附壁影響生長(zhǎng)。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高活菌數(shù)光合細(xì)菌原代菌種的制種方法，其特征在于：所述原代菌種保存為菌種保存于培養(yǎng)架上層，無(wú)陽(yáng)光直射，保持散射光源，同時(shí)持續(xù)處于間隔20~40min自動(dòng)持續(xù)攪拌1~5min。