[發明專利]草莓psy和pds基因二價植物表達載體及構建方法

無效

• 申請號: 201210254078.7
• 申請日: 2012-07-20
• 公開（公告）號: CN102766651A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 朱海生;溫慶放
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院作物研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66
• 代理公司: 福州市鼓樓區京華專利事務所(普通合伙) 35212
• 代理人: 宋連梅

【技術領域】

本發明涉及基因工程領域，特別涉及一種psy和pds基因二價植物表達載體及構建方法。

【背景技術】

類胡蘿卜素（Carotenoids）是自然界中廣泛存在的色素，是植物、細菌、真菌光合反應必不可缺的成分，在高等植物中，類胡蘿卜素主要存在于葉片的葉綠體以及許多花和果實的有色體中，使花和果實呈亮黃色、橙色或紅色。越來越多的醫學研究表明，除了不少類胡蘿卜素是維生素A的前體外，許多類胡蘿卜素在猝滅自由基、增強人體免疫力、預防心血管疾病和防癌抗癌等保護人類健康方面起著重要的作用。因此類胡蘿卜素既是決定水果、蔬菜內在營養品質的重要指標，也是影響果實外觀品質和花卉觀賞價值的重要因素，了解植物類胡蘿卜素積累的特點與代謝的生理機制，對于進一步調控植物類胡蘿卜素的生物合成途徑，改善園藝植物的食用品質和觀賞品質具有重要的意義。八氫番茄紅素合成酶(phytoene?synthase，PSY)和八氫番茄紅素去飽和酶(phytoene?desaturase，PDS)是類胡蘿卜素生物合成過程中關鍵酶。PSY是類胡蘿卜素生物合成過程中關鍵酶之一，它催化兩個牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl?pyrophosphate，GGPP)縮合形成八氫番茄紅素，八氫番茄紅素是整個類胡蘿卜素合成途徑中第一個類胡蘿卜素分子。由于PSY是植物中類胡蘿卜素生物合成的一個限速酶，所以由GGPP生成八氫番茄紅素這一步驟已成為類胡蘿卜素代謝途徑的“瓶頸”，而其編碼的基因也成為應用基因工程技術改善植物類胡蘿卜素含量的首選目的基因。PDS是植物類胡蘿卜素合成中去飽和的非常重要的一類酶，參與線狀類胡蘿卜素生物合成。PDS催化八氫番茄紅素連續兩次脫氫生成ζ-胡蘿卜素，然后在ZDS催化下，ζ-胡蘿卜素脫氫生成鏈孢紅素繼而進一步脫氫生成番茄紅素，PDS是類胡蘿卜素合成途徑中的重要限速酶。

將外源基因導人植物基因組是植物分子生物學和遺傳工程的一項基本技術。基因轉化首先必須構建含有目的基因的植物表達載體，植物表達載體的構建是一個十分復雜的過程，要綜合考慮了目的基因的編碼區和植物表達載體的酶切位點及翻譯蛋白移碼問題基礎上，涉及到多次大分子重組，每次重組過程又包括質粒提取、酶切、回收、連接、轉化和篩選鑒定等工作。由于生物體內的代謝途徑常常涉及多步反應，除了需要單個酶催化，更需要兩個或多個酶共同催化。因此將多基因轉化到同一植物中，就顯得很有必要了。多基因表達載體構建與轉化技術的誕生使多個目的基因導入植物基因組中并在植物中表達得以實現。構建多表達框載體策略是多個目的基因的兩端均具有各自的啟動子、增強序列、終止子等轉錄和翻譯調控元件，將它們串聯在一起共同組建于一個表達載體中，當這種表達載體構建好后，只要通過一次轉化就可以方便而成功地獲得多價基因同時表達的轉基因植物。目前已經廣泛應用各類生物當中。

【發明內容】

本發明要解決的技術問題之一，在于提供一種草莓psy和pds基因二價植物表達載體，通過psy和pds基因協同表達能夠提高草莓果實類胡蘿卜素含量，并為研究草莓類胡蘿卜素生物合成途徑中各種代謝酶的調控功能以及類胡蘿卜素積累特點和代謝機制奠定技術平臺。

本發明是這樣解決的技術問題之一的：

一種草莓psy和pds基因二價植物表達載體，所述草莓基因二價植物表達載體為草莓的psy和pds基因串聯二價植物表達載體，所述psy和pds基因分別具有獨立轉錄調控元件和表達盒，所述表達載體的基因序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發明要解決的技術問題之二，在于提供一種草莓基因二價植物表達載體的構建方法，該構件方法大大提高了載體構建成功的概率，節約構建載體的時間，縮小工作量；通過psy、pds基因協同表達能夠提高草莓果實類胡蘿卜素含量。

本發明是這樣解決的技術問題之二的：

一種草莓psy和pds基因二價植物表達載體的構建方法，所述構建方法包括以下步驟：

步驟10、分別根據已克隆的草莓psy和pds基因的cDNA全長序列，結合植物雙元表達載體pCAMBIA1301和pBI121載體上的酶切位點，設計2對含有不同酶切位點的引物；并利用這2對引物，以草莓總RNA為模版，通過RT-PCR法分別克隆草莓psy和pds的開放閱讀框，連接到pMD18-T?simple載體上，得到重組質粒pMD18-psy和pMD18-pds；