[發明專利]草莓psy和pds基因二價植物表達載體及構建方法

無效

• 申請號: 201210254078.7
• 申請日: 2012-07-20
• 公開（公告）號: CN102766651A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 朱海生;溫慶放
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院作物研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66
• 代理公司: 福州市鼓樓區京華專利事務所(普通合伙) 35212
• 代理人: 宋連梅

1.一種草莓psy和pds基因二價植物表達載體，其特征在于：所述草莓基因二價植物表達載體為草莓的psy和pds基因串聯二價植物表達載體，所述psy和pds基因分別具有獨立轉錄調控元件和表達盒，所述表達載體的基因序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.一種草莓psy和pds基因二價植物表達載體的構建方法，其特征在于：所述構建方法包括以下步驟：

步驟10、分別根據已克隆的草莓psy和pds基因的cDNA全長序列，結合植物雙元表達載體pCAMBIA1301和pBI121載體上的酶切位點，設計2對含有不同酶切位點的引物；并利用這2對引物，以草莓總RNA為模版，通過RT-PCR法分別克隆草莓psy和pds的開放閱讀框，連接到pMD18-T?simple載體上，得到重組質粒pMD18-psy和pMD18-pds；

步驟20、將重組質粒pMD18-psy上的psy基因插入到質粒載體pCAMBIA1301的NcoⅠ和Bst?EⅡ酶切位點之間，經PCR、酶切和測序鑒定后，構建成psy基因單價植物表達載體pCAMBIA1301psy；

步驟30、將重組質粒pMD18-pds上的pds基因插入到質粒載體pBI121的XbaⅠ和BamHⅠ酶切位點之間，經PCR、酶切和測序鑒定后，構建成pds基因單價植物表達載體pBI121pds，所述單價植物表達載體pBI121pds上含35s啟動子、pds基因、gusA基因和Nos終止子；

步驟40、將步驟30的單價植物表達載體pBI121pds上的含35s啟動子、pds基因、gusA基因和Nos終止子片段插入到步驟20的單價植物表達載體pCAMBIA1301psy的EcoRⅠ和PstⅠ酶切位點之間形成重組質粒，對該重組質粒進行PCR、酶切和測序鑒定后，最后構建成psy和pds基因雙價植物表達載體pCAMBIA1301psy-pds。

3.根據權利要求2所述的草莓psy和pds基因二價合植物表達載體的構建方法，其特征在于：步驟10中所述psy和pds基因的引物及其對應酶切位點如下：

psy基因的PSYF引物的引物序列如SEQ?ID?NO.2所示，其酶切位點為NcoⅠ；psy基因的PSYR引物的引物序列如SEQ?ID?NO.3所示，其酶切位點為Bst?EⅡ；

pds基因的PDSF引物的引物序列如SEQ?ID?NO.4所示，其酶切位點為XbaⅠ；pds基因的PDSR引物的引物序列如SEQ?ID?NO.5所示，其酶切位點為BamHⅠ。

4.根據權利要求2所述的草莓psy和pds基因二價植物表達載體的構建方法，其特征在于：

所述步驟20具體如下：所述重組質粒pMD18-psy經限制性內切酶NcoⅠ和Bst?EⅡ消化后，從中回收1194bp的基因片段，與經限制性內切酶Nco?Ⅰ和Bst?EⅡ消化的質粒載體pCAMBIA1301中回收的基因大片段，通過T4DNA連接酶連接后，再進行PCR、酶切和測序鑒定，最后構建成psy基因單價植物表達載體pCAMBIA1301psy；

所述步驟30具體如下：所述重組質粒pMD18-pds經限制性內切酶XbaⅠ和BamHⅠ消化后，從中回收1704bp的基因片段，與經限制性內切酶XbaⅠ和BamHⅠ消化的質粒載體pBI121中回收的基因大片段，通過T4DNA連接酶連接后，再進行PCR、酶切和測序鑒定，最后構建成pds基因單價植物表達載體pBI121pds；

所述步驟40具體如下：將步驟30的單價植物表達載體pBI121pds用EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切回收長度為4720bp的含35s啟動子、pds基因、gusA基因和Nos終止子的基因片段；同時將步驟20的單價植物表達載體pCAMBIA1301psy的進行EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切，純化后與長度為4720bp的基因片段進行連接形成重組質粒，接著對該重組質粒進行PCR、酶切和測序鑒定，最后構建成psy和pds基因雙價植物表達載體pCAMBIA1301psy-pds。

5.根據權利要求3或4所述的草莓psy和pds基因二價植物表達載體的構建方法，其特征在于：所述單價植物表達載體pBI121pds中pds基因具有獨立轉錄調控元件和含35s啟動子、pds基因和Nos終止子的表達盒；所述單價植物表達載體pCAMBIA1301psy中的psy基因也具有獨立轉錄調控元件和含35s啟動子、psy基因和Nos終止子的表達盒。