[發(fā)明專利]一種檢測EGFR蛋白的試劑盒及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210253713.X
• 申請日: 2012-07-23
• 公開（公告）號: CN103575901A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐海偉;李勇;胡慶鋒;常立峻;陳秀發(fā)
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州長光華醫(yī)生物試劑有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/76;G01N33/531
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測EGFR蛋白的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

1)EGFR蛋白校準(zhǔn)品；

2)鏈親和素偶聯(lián)的固相載體；

3)生物素化的EGFR蛋白配體；

4)5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶聯(lián)標(biāo)記的EGFR蛋白配體；以及

5)上述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉所作用的化學(xué)發(fā)光底物。

2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述EGFR蛋白為表皮生長因子受體。

3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述EGFR蛋白校準(zhǔn)品為表皮生長因子受體配制的校準(zhǔn)品凍干品，校準(zhǔn)品內(nèi)所用的保護(hù)基質(zhì)蛋白為牛血清白蛋白，卵清蛋白。

4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述鏈親和素偶聯(lián)的固相載體為磁性顆粒，塑料顆粒。

5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述EGFR蛋白配體為可以與EGFR蛋白特異性結(jié)合反應(yīng)的單克隆抗體、多克隆抗體、基因工程抗體、蛋白質(zhì)、大分子有機(jī)化合物。

6.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉結(jié)構(gòu)式如(I)所示：

(I)

結(jié)構(gòu)式(I)中R為n為1～4的自然數(shù)。

7.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶聯(lián)標(biāo)記的EGFR蛋白配體所用的偶聯(lián)劑為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。

8.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉所作用的化學(xué)發(fā)光底物為吖啶酯、吖啶磺酰胺。

9.一種制備權(quán)利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟：

1)以EGFR蛋白純品配制EGFR蛋白校準(zhǔn)品；

2)使鏈親和素偶聯(lián)固相載體；

3)使EGFR蛋白配體生物素化；

4)用5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶聯(lián)標(biāo)記EGFR蛋白配體；

5)配制化學(xué)發(fā)光底物液；

6)分裝上述EGFR蛋白校準(zhǔn)品、鏈親和素偶聯(lián)固相載體、生物素化的EGFR蛋白配體、5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶聯(lián)標(biāo)記的EGFR蛋白配體和化學(xué)發(fā)光底物液；以及

7)組裝為成品。

10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述制備EGFR蛋白校準(zhǔn)品的步驟1)采用以下方法：

配制含牛血清白蛋白2％，卵清蛋白1.5％，水解明膠0.5％，2.5％蔗糖的0.01M?PB緩沖溶液為校準(zhǔn)品基質(zhì)液，用基質(zhì)液配制含不同濃度EGFR蛋白的校準(zhǔn)品，用西林瓶分裝1mL/瓶，凍干處理后，-20℃保存。

11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述制備鏈親和素化固相載體的步驟2)采用以下磁性顆粒方法：

250mg氨基末端磁性顆粒置于燒杯，加入甲醇及丙酮各5mL反復(fù)清洗，磁性分離，棄去上清，加入DMF溶解的10mL0.2％的1，4一苯二異硫氰酸酯(PDITC)溶液，置于恒溫振蕩器，反應(yīng)10h，最后將反應(yīng)后的磁性顆粒用丙酮及超純水反復(fù)清洗6遍，取新制備經(jīng)PDITC活化的磁性顆粒置于30mL離心管中，加入PBS25mL，加入4mg鏈親和素，置于恒溫振蕩器中反應(yīng)20min，磁性分離，測定反應(yīng)前后溶液在280nm的OD值，以PBS清洗3次，收集，加入等量丙三醇，-20℃保存。

12.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述制備鏈親和素化固相載體的步驟2)采用以下塑料顆粒方法：

250mg氨基末端塑料顆粒置于燒杯，加入甲醇及丙酮各5mL反復(fù)清洗，離心分離，棄去上清，加入DMF溶解的10mL0.2％的1，4一苯二異硫氰酸酯(PDITC)溶液，置于恒溫振蕩器，反應(yīng)10h，最后將反應(yīng)后的塑料顆粒用丙酮及超純水反復(fù)清洗6遍，取新制備經(jīng)PDITC活化的塑料顆粒置于30mL離心管中，加入PBS25mL，加入4mg鏈親和素，置于恒溫振蕩器中反應(yīng)20min，離心分離，測定反應(yīng)前后溶液在280nm的OD值，以PBS清洗3次，收集，加入等量丙三醇，-20℃保存。