[發明專利]一種用于同源重組的自轉運載體及其構建的經粘膜免疫疫苗

有效

• 申請號: 201210253376.4
• 申請日: 2012-07-20
• 公開（公告）號: CN102787134A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 王一理;于軍;許丹;楊筱鳳
• 申請（專利權）人: 西安交通大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/09;A61K48/00;A61P35/00;A61P31/20
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

技術領域

本發明屬于宮頸癌預防疫苗技術領域，涉及一種用于同源重組的自轉運載體及其構建的經粘膜免疫疫苗。

背景技術

由于多數微生物感染發生在粘膜，機體在粘膜免疫組織誘導產生保護性體液免疫和細胞免疫反應，通過非粘膜免疫途徑的疫苗難以誘導有效的粘膜免疫反應，理想的粘膜系統保護性抗原運輸載體的研究成為疫苗研究中的重點。

已有報道利用減毒腸道或腸道相關組織生長繁殖的細菌和病毒，能夠較有效地刺激局部和系統免疫反應。如應用減毒沙門氏菌體作為載體菌，表達外源保護性抗原，但尚不足以解決外源基因的穩定性和載體安全性問題。

宮頸癌是世界范圍內僅次于乳腺癌的婦女惡性腫瘤，臨床和分子流行病學研究已經證實高危型人乳頭瘤病毒（HPV）是宮頸癌和宮頸不典型增生的主要始動因子，90%以上的宮頸癌標本中可撿出HPV，其中HPV16占50％以上，其余部分主要與HPV18、31、45有關；HPV6、11為尖銳濕疣等良性肛生殖區粘膜增生性病變的主要病因，因此，預防HPV感染是降低宮頸癌及其它HPV相關性腫瘤的最為適宜的策略，而應用HPV疫苗是預防HPV感染的最佳途徑。

目前HPV預防性疫苗的研究主要集中于基因工程病毒樣顆粒（virus-like?particles?VLP）疫苗。但是由于種種內在缺陷，基于減毒活細菌載體的HPV疫苗作為最具代表性的第二代疫苗越來越多地受到了研究者們的青睞。首先，相對簡單的制備過程和運輸過程大大降低了疫苗生產和使用成本，與VLP疫苗高昂的接種費用相比，更有可能在包括中國在內的發展中國家里推廣；其次，與VLP疫苗的肌肉注射免疫相比，經口或者其他粘膜免疫途徑的非侵入式免疫途徑更容易被以青少年為主的免疫人群所接受。

發明內容

本發明解決的問題在于提供一種用于同源重組的自轉運載體及其構建的經粘膜免疫疫苗，將外源HPV的抗原蛋白整合入腸道菌自轉運蛋白中實現抗原基因在載體基因組中的穩定存在和抗原的表面遞呈，從而開發能夠誘導有效粘膜免疫反應的疫苗。

本發明是通過以下技術方案來實現：

一種用于同源重組的icsA自轉運載體，包括N1-外源序列-C2的基因片段，其中N1為表達IcsA的氨基酸轉膜信號肽的N1序列，C2為表達IcsA羧基端β區域的C2序列，N1序列和C2序列之間為表達外源性抗原的序列；N1序列、C2序列的上游和下游均設有同源序列。

所述的N1序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；C2序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

所述的外源性序列為HPV16?L1的基因序列。

所述的N1序列與HPV16?L1之間設有同源序列ctagaactat?gagcct，HPV16L1與C2序列之間設有同源序列ggaagctgag?tactat；N1序列的前端還設有同源序列cggtacccgg?ggatc，C2序列的后端還設有同源序列gatcctctag?agtcg。

所述的N1-外源序列-C2的基因片段克隆于pUC19載體的多克隆位點之間，構成pUC19-icsA-L1載體；

或者克隆于pJCB12載體的多克隆位點之間，構成pJCB12-icsA-L1載體。

一種基于自轉運蛋白重組的粘膜免疫疫苗，以具有自轉運蛋白穿膜運載體系的革蘭氏陰性腸道菌作為宿主細胞，通過同源重組，將自轉運蛋白基因的表達氨基酸轉膜信號肽與羧基端轉膜區域之間的表達功能蛋白的序列替換為表達外源性抗原的序列；

所述的革蘭氏陰性腸道菌包括志賀氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌和霍亂弧菌。

所述的宿主細胞為野生型宋氏志賀氏桿菌，通過同源重組，將HPV16?L1基因序列替代icsA基因中第863～1518bp的序列。

所述的HPV16?L1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，而IcsA基因中第863～1518bp的序列表達IcsA蛋白的第105～506位氨基酸的α結構域。

所述的同源重組為：