[發(fā)明專利]一種用于同源重組的自轉運載體及其構建的經(jīng)粘膜免疫疫苗

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210253376.4
• 申請日: 2012-07-20
• 公開（公告）號: CN102787134A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發(fā)明（設計）人: 王一理;于軍;許丹;楊筱鳳
• 申請（專利權）人: 西安交通大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/09;A61K48/00;A61P35/00;A61P31/20
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

1.一種用于同源重組的icsA自轉運載體，其特征在于，包括N1-外源序列-C2的基因片段，其中N1為表達IcsA的氨基酸轉膜信號肽的N1序列，C2為表達IcsA羧基端β區(qū)域的C2序列，N1序列和C2序列之間為表達外源性抗原的序列；N1序列、C2序列的上游和下游均設有同源序列。

2.如權利要求1所述的用于同源重組的icsA自轉運載體，其特征在于，所述的N1序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；C2序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

3.如權利要求1所述的用于同源重組的icsA自轉運載體，其特征在于，所述的外源性序列為HPV16?L1的基因序列。

4.如權利要求3所述的用于同源重組的icsA自轉運載體，其特征在于，所述的N1序列與HPV16?L1之間設有同源序列ctagaactat?gagcct，HPV16?L1與C2序列之間設有同源序列ggaagctgag?tactat；N1序列的前端還設有同源序列cggtacccgg?ggatc，C2序列的后端還設有同源序列gatcctctag?agtcg。

5.如權利要求1所述的用于同源重組的icsA自轉運載體，其特征在于，所述的N1-外源序列-C2的基因片段克隆于pUC19載體的多克隆位點之間，構成pUC19-icsA-L1載體；

或者克隆于pJCB12載體的多克隆位點之間，構成pJCB12-icsA-L1載體。

6.一種基于自轉運蛋白重組的粘膜免疫疫苗，其特征在于，以具有自轉運蛋白穿膜運載體系的革蘭氏陰性腸道菌作為宿主細胞，通過同源重組，將自轉運蛋白基因的表達氨基酸轉膜信號肽與羧基端轉膜區(qū)域之間的表達功能蛋白的序列替換為表達外源性抗原的序列；

所述的革蘭氏陰性腸道菌包括志賀氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌和霍亂弧菌。

7.如權利要求6所述的基于自轉運蛋白重組的粘膜免疫疫苗，其特征在于，所述的宿主細胞為野生型宋氏志賀氏桿菌，通過同源重組，將HPV16?L1基因序列替代icsA基因中第863～1518bp的序列。

8.如權利要求6所述的基于自轉運蛋白重組的粘膜免疫疫苗，其特征在于，所述的HPV16?L1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，而IcsA基因中第863～1518bp的序列表達IcsA蛋白的第105～506位氨基酸的α結構域。

9.如權利要求6所述的基于自轉運蛋白重組的粘膜免疫疫苗，其特征在于，所述的同源重組為：

以電穿孔方式轉化有pJCB12-icsA-L1載體的SM10λpir作為同源重組供體菌；所述的pJCB12-icsA-L1載體是將N1-HPV16?L1-C2的基因片段克隆于pJCB12載體的多克隆位點之間，N1序列與HPV16?L1之間設有同源序列ctagaactat?gagcct，HPV16?L1與C2序列之間設有同源序列ggaagctgag?tactat；N1序列的前端還設有同源序列cggtacccgg?ggatc，C2序列的后端還設有同源序列gatcctctag?agtcg；

以具有鏈霉素抗性的野生型志賀氏桿菌作為同源重組受體菌；

將同源重組供體菌與同源重組受體菌混合后，在LB瓊脂平板上于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16，使同源重組供體菌與同源重組受體菌之間充分發(fā)生接合，進而發(fā)生第一次同源重組，使pJCB12載體整合進入志賀氏桿菌基因組中；

篩選第一次同源重組的陽性菌落后，以5%蔗糖為選擇壓力誘導第二次同源重組，剔除其余載體而保留兩側同源序列之間的HPV16?L1基因序列，使HPV16?L1基因整合進入icsA基因，替代轉膜信號肽與羧基端轉膜區(qū)域之間的序列。

10.權利要求7所述的基于自轉運蛋白重組的粘膜免疫疫苗在制備抗宮頸癌的藥物或疫苗中的應用。