[發明專利]一種檢測鰱魚卵黃蛋白原試劑盒的制備及檢測方法

有效

• 申請號: 201210252420.X
• 申請日: 2012-07-20
• 公開（公告）號: CN102768282A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 廖濤;付云潔;熊光權;徐宏書;王少華;吳文錦;葉敏;李新;耿勝榮;鉏曉艷;夏和舟
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所;湖北同泰生物工程有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 朱盛華

技術領域

本發明屬于淡水產品環境分析領域，具體涉及一種檢測鰱魚卵黃蛋白原試劑盒的制備及檢測方法。?

背景技術

類雌激素是一類具有雌激素活性,?能夠模擬雌激素功能的環境化學物。研究表明人類的許多生殖障礙、發育異常及某些癌癥的發生都與類雌激素有關。這些污染物在環境中的最終歸宿是各種水體，并通過食物鏈的傳遞在魚體內富集，而卵黃蛋白原（VTG）是魚體中類雌激素污染的特異性生物標志物。目前對蛋白質進行定量分析主要有高壓液相色譜（HPLC）、毛細管電泳（CE）和液相色譜-質譜聯用儀（LC-MS）等化學分析方法，但由于化學分析需要提取、富集和濃縮等步驟，前處理復雜，費時、費力，靈敏度低，不適合大量樣品的分析和篩選。?

鰱魚是我國主要的水產養殖和加工品種，而卵黃蛋白原的主要分子特征在種間都存在較大變異性，因此需要在鰱魚VTG純化和特異性多克隆抗體產生基礎上制備檢測鰱魚卵黃蛋白原的試劑盒，用來快速測定鰱魚血清、勻漿液及相關液體樣本中VTG的含量，以此評價鰱魚體內類雌激素污染狀況，為我國類雌激素污染控制決策的制定提供科學依據。?

發明內容

本發明的目的是針對上述現狀，旨在提供一種能快速測定鰱魚血清、勻漿液及相關液體樣本中VTG的含量，以此評價鰱魚體內類雌激素污染狀況的檢測鰱魚卵黃蛋白原試劑盒的制備及檢測方法。?

本發明目的的實現方式為，一種檢測鰱魚卵黃蛋白原試劑盒的制備方法，具體步驟如下，?

（1）鰱魚卵黃蛋白原的誘導和分離純化：?

①配制100ng/L?的17α-乙炔基雌二醇充氣水溶液，將3-4月齡的鰱魚幼魚養殖在配制的水溶液中，暴露10天，斷尾采血獲得血清；?

②血清通過陰離子交換層析柱，所述陰離子交換層析柱填料為DEAE??Sepharose?CL-6B，陰離子交換層析柱用pH?7.5、0.025M?Tris-HCl緩沖液平衡，加入1ｍＬ血清樣品，用含0.1-0.5M?NaCl?、pH?7.5的0.025M?Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫，經電泳鑒定，收集含卵黃蛋白原蛋白的洗脫液，透析脫鹽后，冷凍干燥制備純化的鰱魚VTG凍干粉；?

（2）鰱魚卵黃蛋白原多克隆抗體的制備：?

①大白兔先用弗氏完全佐劑進行預免疫，一周后將0.5mg/mL的卵黃蛋白原蛋白液與弗氏完全佐劑按照1:1的比例進行初次免疫，兩周后將0.5mg/mL的卵黃蛋白原蛋白液與弗氏不完全佐劑按照1:1的比例進行重復免疫；?

②15天后，從兔耳緣靜脈抽取少量血液測量抗體的效價；若抗體效價足夠高，則從兔頸動脈放血，制備鰱魚卵黃蛋白原的抗血清，抗血清經辛酸硫酸銨法純化，透析離心后得到特異性的抗VTG多克隆抗體（即一抗），分裝保存；?

（3）鰱魚卵黃蛋白原檢測試劑盒制備：將步驟（1）②制備的純化的鰱魚VTG凍干粉、步驟（2）②制備的一抗和酶標記的二抗及酶標板放入試劑盒內得檢測鰱魚卵黃蛋白原試劑盒。?

一種用鰱魚卵黃蛋白原試劑盒檢測鰱魚體內VTG的方法，其步驟如下：?

（1）用權利要求1步驟（1）②制備的純化的鰱魚VTG凍干粉作為標準蛋白，在酶標板中按照100μL/孔量加入0.025M?Tris-HCl稀釋的樣品溶液和梯度稀釋的VTG標準蛋白溶液，制作標準曲線，放入濕盒后4℃過夜；?

（2）倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次拍干后，按照100μL/孔量加入稀釋1:2000倍的抗鰱魚VTG多克隆抗體到酶標板，37℃保溫反應0.5h；?

（3）倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次拍干后，按照100μL/孔量加入稀釋1:2000倍的酶標記的二抗到酶標板，37℃保溫反應0.5h；?

（4）倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次，拍干后，按照100μL/孔量加入配制好的3,3,5,5-四甲基聯苯胺底物溶液，37℃下顯色反應15min后，按照50μL/孔加入2M硫酸終止反應，用酶標儀測定450nm處的吸光度值，根據步驟（1）制作的標準曲線來計算鰱魚樣品中VTG的濃度。?

本發明通過分離純化鰱魚體內的VTG，然后免疫大白兔制備多克隆抗體，從而制備出檢測鰱魚體內VTG的酶聯免疫吸附測定試劑盒，采用本檢測鰱魚卵黃蛋白原試劑盒能快速測定鰱魚血清、勻漿液及相關液體樣本中VTG的含量，以此評價?鰱魚體內類雌激素污染的狀況，為我國類雌激素污染控制決策的制定提供科學依據。?