[發明專利]一種檢測鰱魚卵黃蛋白原試劑盒的制備及檢測方法

有效

• 申請號: 201210252420.X
• 申請日: 2012-07-20
• 公開（公告）號: CN102768282A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 廖濤;付云潔;熊光權;徐宏書;王少華;吳文錦;葉敏;李新;耿勝榮;鉏曉艷;夏和舟
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所;湖北同泰生物工程有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 朱盛華

1.一種檢測鰱魚卵黃蛋白原試劑盒的制備方法，其特征在于具體步驟如下，

（1）鰱魚卵黃蛋白原的誘導和分離純化：

①配制100ng/L?的17α-乙炔基雌二醇充氣水溶液，將3-4月齡的鰱魚幼魚養殖在配制的水溶液中，暴露10天，斷尾采血獲得血清；

②血清通過陰離子交換層析柱，所述陰離子交換層析柱填料為DEAE?Sepharose?CL-6B，陰離子交換層析柱用pH?7.5、0.025M?Tris-HCl緩沖液平衡，加入1ｍＬ血清樣品，用含0.1-0.5M?NaCl、pH?7.5的0.025M?Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫，收集含卵黃蛋白原蛋白的洗脫液，透析脫鹽后，冷凍干燥制備純化的鰱魚VTG凍干粉；

（2）鰱魚卵黃蛋白原多克隆抗體的制備：

①大白兔先用弗氏完全佐劑進行預免疫，一周后將0.5mg/mL的卵黃蛋白原蛋白液與弗氏完全佐劑按照1:1的比例進行初次免疫，兩周后將0.5mg/mL的卵黃蛋白原蛋白液與弗氏不完全佐劑按照1:1的比例進行重復免疫；

②15天后，從兔耳緣靜脈抽取少量血液測量抗體的效價；若抗體效價高，則從兔頸動脈放血，制備鰱魚卵黃蛋白原的抗血清，抗血清經辛酸硫酸銨法純化，透析離心后得到特異性的抗VTG多克隆抗體，即一抗，分裝保存；

（3）鰱魚卵黃蛋白原檢測試劑盒制備：將步驟（1）②制備的純化的鰱魚VTG凍干粉、步驟（2）②制備的一抗和酶標記的二抗及酶標板放入試劑盒內，得檢測鰱魚卵黃蛋白原試劑盒。

2.根據權利要求1所述的一種檢測鰱魚卵黃蛋白原試劑盒的制備方法，其特征在于將3-4月齡的鰱魚幼魚100條暴露于100ng/L乙炔基雌二醇的充氣水中，誘導鰱魚幼魚體內產生大量VTG，10天后斷尾采血。

3.根據權利要求1所述的一種檢測鰱魚卵黃蛋白原試劑盒的制備方法，其特征在于裝陰離子交換層析柱后，用0.025M，pH?7.5的Tris-HCl緩沖液預平衡過夜；上1ｍＬ血清樣品后，用NaCl-Tris-HCl洗脫緩沖液進行梯度洗脫，在洗脫緩沖液中加入酶抑制劑PMSF至終濃度為2mM，洗脫速度為1ml/min，每3分鐘收集一管洗脫組分；

所述NaCl-Tris-HCl洗脫緩沖液為0.1-0.5M?NaCl，0.025M?Tris-HCl，pH?7.5的緩沖液。

4.一種用權利要求1所述的檢測鰱魚卵黃蛋白原試劑盒檢測鰱魚體內VTG的方法，其特征在于其步驟如下：

（1）用權利要求1步驟（1）②制備的純化的鰱魚VTG凍干粉作為標準蛋白，在酶標板中按照100μL/孔量加入0.025M?Tris-HCl稀釋的樣品溶液和梯度稀釋的VTG標準蛋白溶液，制作標準曲線，放入濕盒后4℃過夜；

（2）倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次拍干后，按照100μL/孔量加入稀釋1:2000倍的抗鰱魚VTG多克隆抗體到酶標板，37℃保溫反應0.5h；

（3）倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次拍干后，按照100μL/孔量加入稀釋1:2000倍的酶標記的二抗到酶標板，37℃保溫反應0.5h；

（4）倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次，拍干后，按照100μL/孔量加入配制好的3,3,5,5-四甲基聯苯胺底物溶液，37℃下顯色反應15min后，按照50μL/孔加入2M硫酸終止反應，用酶標儀測定450nm處的吸光度值，根據步驟（1）制作的標準曲線來計算鰱魚樣品中VTG的濃度。