[發(fā)明專利]可靶向激活RANK信號(hào)通路的融合蛋白及其重組質(zhì)粒與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210251406.8
• 申請(qǐng)日: 2012-07-18
• 公開（公告）號(hào): CN102851262A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 秦俊文;謝琪璇;蔡冬青;萬穎;黃卉卉;秋山泰身;井上純一郎;禹艷紅;齊緒峰;武征
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 暨南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/14
• 分類號(hào): C12N9/14;C12N15/62;C12N15/63;C12N15/867;C12N15/66;C12Q1/02
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;陳燕嫻

1.一種可靶向激活RANK信號(hào)通路的融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可靶向激活RANK信號(hào)通路的融合蛋白，其特征在于：編碼所述的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

3.一種重組載體，其特征在于：含有編碼如權(quán)利要求1所述的可靶向激活RANK信號(hào)通路的融合蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于：所述的重組載體為將SEQID?NO.2所示的基因克隆至慢病毒載體得到。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于：所述的慢病毒載體為CSII-EF-RfA-IRES2-Venus。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于：所述的重組載體為CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-HG-RANK重組質(zhì)粒，其通過如下方法制備得到：

（1）以結(jié)核桿菌DNA為模板，以FP和RP為引物，PCR反應(yīng)獲得HA-GyraseB基因；

FP:CGGGATCCACCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGTCGAACTCTTATGACTCCTCC

RP：CGGAATTCTTAGGTACCGCCTTCATAGTGGAAGTGGTCTTC；

（2）通過EcoR?I酶和BamH?I酶分別雙酶切pENTR-2B載體和步驟（1）得到的HA-Gyrase?B基因，酶切后純化，得到雙酶切的pENTR-2B載體和雙酶切的HA-Gyrase?B基因；再將雙酶切的pENTR-2B載體和雙酶切的HA-Gyrase?B基因連接，得到重組載體pENTR-2B-HA-Gyrase?B；用Kpn?I酶單酶切重組載體pENTR-2B-HA-Gyrase?B，去磷酸化，得到單酶切后的pENTR-2B-HA-Gyrase?B；

（3）以小鼠胸腺cDNA為模板，F(xiàn)P2和RP2為引物，PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到RANK跨膜區(qū)域和包內(nèi)區(qū)域基因；用Kpn?I酶單酶切RANK跨膜區(qū)域和包內(nèi)區(qū)域基因，得到單酶切后的RANK跨膜區(qū)域和包內(nèi)區(qū)域基因；

FP2：CGGGTACCCCCAGTCTCATCGTTCTGCTC；

RP2：CCGGGTACCTCATTCTGCACATTGTCCGGAC；

（4）將步驟（2）得到的單酶切后的pENTR-2B-HA-Gyrase?B和步驟（3）得到的單酶切后的RANK跨膜區(qū)域和包內(nèi)區(qū)域基因連接，得到重組載體pENTR-2B-HG-RANK；

（5）通過Gateway技術(shù)將位于重組載體pENTR-2B-HG-RANK上的HG-RANK雙鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至慢病毒載體CSII-EF-RfA-IRES2-Venus上，得到CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-HG-RANK重組質(zhì)粒。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于：

步驟（1）和（2）中所述的PCR反應(yīng)的條件為：94℃2min；94℃15sec、55℃15sec、68℃30sec，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于：

步驟（5）所述的Gateway技術(shù)的反應(yīng)體系為：

其中，TE的組成為10mM?Tris-HCl、1mMEDTA，pH值為8；

反應(yīng)條件為：25℃下反應(yīng)6小時(shí)，加1μl濃度為2μg/μl的蛋白酶K，37℃反應(yīng)10分鐘。

9.權(quán)利要求3～8任一項(xiàng)所述的重組載體在RANK功能研究中的應(yīng)用。