[發明專利]基于TAS途徑增強病毒誘導基因沉默效率的方法及應用

有效

• 申請號: 201210250444.1
• 申請日: 2012-07-19
• 公開（公告）號: CN102851310A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 周雪平;顧周杭;吳建祥
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

技術領域

本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一種基于trans-acting?smallRNA即TAS途徑增強病毒誘導基因沉默效率的方法及應用。?

背景技術

病毒誘導的基因沉默(VIGS)現象是植物抗病毒侵染的一種自然機制。當病毒入侵植物時，病毒基因組轉錄產生病毒來源的RNA（vsRNA）被植物細胞防御機制中一些蛋白所識別，經過RNA-dependent?RNA?Polymerase?6（RDR6）復制，使原本單鏈的vsRNA形成了雙鏈RNA（dsRNA）。該dsRNA在植物體內迅速被Dicer-like?(DCL)的RNaseIII酶切割形成大小約為21-24?nt的?short?interfering?RNA（siRNA），siRNA與Argonaute?(AGO)RNA結合蛋白以及其他RNase結合形成RNA誘導的沉默復合體(?RNA-induced?silencing?complex，RISC)，這一RISC復合體能夠特異地與同源的靶標mRNA結合，并降解這些靶標mRNA，從而達到抗病毒的目的。利用這一機制，我們可以在病毒侵染性克隆上插入植物內源的基因片段，當該病毒侵染植物時，誘發VIGS反應，從而可以特異沉默植物內源基因的表達。?

Trans-acting?smallRNA（tasiRNA）是一種特殊的small?RNA，主要存在于植物當中。TAS途徑主要是一段非編碼的RNA，在miRNA特異識別后，?RISC和RDR6等蛋白相互作用后產生的一系列特定大小的sRNA片段。在擬南芥中TAS途徑主要有三種，分別是TAS1、TAS2和TAS3。其中TAS1和TAS2都是依賴于ath-miR173識別，從而發生切割過程。而TAS3是依賴于ath-miR390識別從而發生切割。?

棉花皺葉病毒（Cotton?leaf?crumple?virus,?CLCrV）屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus），是棉花上的重要病毒之一，對棉花的生產有著嚴重威脅。本發明利用CLCrV基因沉默載體，通過對外源目的片段進行修飾，使其通過TAS途徑對棉花內源基因進行沉默，以達到增強目的基因沉默效率的作用，從而為植物基因組功能的研究和分析服務。?

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發明內容

本發明的目的是提供一種基于trans-acting?smallRNA即TAS途徑以增強病毒誘導基因沉默效率的方法及應用。?

基于trans-acting?smallRNA即TAS途徑以增強病毒誘導基因沉默效率的方法是通過分子生物學方法對植物病毒沉默載體中沉默靶基因片段進行修飾，使其同時含有如下序列：5’TS（5’-GTGATTTTTCTCTACAAGCGAA-3’）的5’TS結構和3’MIR(5’-ATATTTGGAGACCGTCAGATTCGAATCTGAACAAAGCATAAAAAAGTCAACAAAACTTAAAGCGGCGGTCTCATCGTAATCTCAGCCCAATACCCTATTTTCCTCTCCCCTATATAAATACTTTCTTCTTCTACTGATCTTCTTCTCACAAATAAACCCAAATATATCAATCTACTGTGTTGGTGATTAAGTACTTTCGCTTGCAGAGAGAAATCACAGTGGTCAAAAAAGTTGTAGTTTTCTTAAAGTCTCTTTCCTCTGTGATTCTCTGTGTAAGCGAAAGAGCTTGCTCCCTAAACTTATCTCTCTGATGATTTAATGTTAGAGATCTTCGTAAATCTATGTGTTTGATAGATCTGATGCGTTTTTTGAGTTGATGATTTGATTATTTTTCACTGGAAAGTATCTCATTAGGGTAACGATAATGTTTTATGGATTTGGTTGTATAACAGATCCATGAAATCTTGACTGGTTATAAAATCTGAATAATGTATTTCAAT-3’)的miR73前體片段兩部分序列，以達到增強基因沉默效率。?

所述的對植物病毒沉默載體中沉默靶基因片段進行修飾的方法的步驟如下：?