[發明專利]基于TAS途徑增強病毒誘導基因沉默效率的方法及應用

有效

• 申請號: 201210250444.1
• 申請日: 2012-07-19
• 公開（公告）號: CN102851310A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 周雪平;顧周杭;吳建祥
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

1.一種基于trans-acting?smallRNA即TAS途徑以增強病毒誘導基因沉默效率的方法，其特征在于通過分子生物學方法對植物病毒沉默載體中沉默靶基因片段進行修飾，使其同時含有如下序列：5’TS（5’-GTGATTTTTCTCTACAAGCGAA-3’）的5’TS結構和3’MIR(5’-ATATTTGGAGACCGTCAGATTCGAATCTGAACAAAGCATAAAAAAGTCAACAAAACTTAAAGCGGCGGTCTCATCGTAATCTCAGCCCAATACCCTATTTTCCTCTCCCCTATATAAATACTTTCTTCTTCTACTGATCTTCTTCTCACAAATAAACCCAAATATATCAATCTACTGTGTTGGTGATTAAGTACTTTCGCTTGCAGAGAGAAATCACAGTGGTCAAAAAAGTTGTAGTTTTCTTAAAGTCTCTTTCCTCTGTGATTCTCTGTGTAAGCGAAAGAGCTTGCTCCCTAAACTTATCTCTCTGATGATTTAATGTTAGAGATCTTCGTAAATCTATGTGTTTGATAGATCTGATGCGTTTTTTGAGTTGATGATTTGATTATTTTTCACTGGAAAGTATCTCATTAGGGTAACGATAATGTTTTATGGATTTGGTTGTATAACAGATCCATGAAATCTTGACTGGTTATAAAATCTGAATAATGTATTTCAAT-3’)的miR73前體片段兩部分序列，以達到增強基因沉默效率。

2.如權利要求1所述的一種基于trans-acting?smallRNA即TAS途徑以增強病毒誘導基因沉默效率的方法，其特征在于對植物病毒沉默載體中沉默靶基因片段進行修飾的方法的步驟如下：

1）在NCBI網站的GenBank中通過序列比對，搜索需要沉默的靶基因如CHLI序列，設計PCR克隆靶基因序列的特異引物Mir173_TS?F：5’-gactagtcGTGATTTTTCTCTACAAGCGAAAGAAGTCCAGGCTCAAAT-3’和Mir173?su86bp?R:?5’-ccttaattaaggTAGGTGCTACTGAAGATAGG-3’，其中F中的下劃線為5’TS結構;

2）以植物如棉花基因組DNA為模板，用步驟1設計的特異引物Mir173_TS?F和Mir173?su86bp?R通過PCR方法，使克隆的靶基因5’端含有5’TS結構，命名為tsSU，然后將tsSU通過SpeI和PacI酶切位點，構建到病毒沉默載體pCLCrVA中，得到pCLCrVtsSU；

3）以擬南芥基因組為模板，通過miR173F：ccttaattaagg?

ATATTTGGAGACCGTCAGATTCGA和miR73R：

aggcgcgcctATTGAAATACATTATTCAGATTTTATAACC這對引物擴增得到500bp左右miR73前體片段，命名為3’MIR，然后將3’MIR通過AscI和PacI酶切位點，連入步驟2）的pCLCrVtsSU中，得到pCLCrVtsmiR173；

4）將pCLCrVtsmiR173和pCLCrVB分別電擊轉化到農桿菌EHA105中，得到含pCLCrVtsmiR173的EHA105和含pCLCrVB的EHA105兩個菌株；

5）將含pCLCrVtsmiR173的EHA105和含pCLCrVB的EHA105菌液以1:1的比例混合后，一次性1ml注射器吸取上述混合液，在2-3周棉花幼苗子葉背面進行浸潤，用針頭在子葉背面刺小洞以便于浸潤；

6）浸潤后的棉花幼苗，放于溫室培養，培養條件為：溫度為23～27℃，相對濕度為65?%～75?%，光周期為16L：8D；10-20天后觀察CHLI基因沉默表型變化；

7）經過實時定量PCR檢測，相比于對照組CLCrVtsSu接種植株，接種CLCrVtsmiR173的植株體內CHLI表達量下降情況。

3.一種如權利要求書1所示基于trans-acting?smallRNA即TAS途徑以增強病毒誘導基因沉默效率的方法的應用，其特征在于它用于植物基因組功能的分析和研究。