[發明專利]一種紫杉醇菌株的篩選方法及其半定量分析

無效

• 申請號: 201210249811.6
• 申請日: 2012-07-19
• 公開（公告）號: CN102796800A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 臧威;孫劍秋;范呈浪;尹軍霞;沈國娟
• 申請（專利權）人: 紹興文理學院
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;G01N30/90
• 代理公司: 紹興市越興專利事務所 33220
• 代理人: 王余糧

技術領域

本發明涉及一種紫杉醇菌株的篩選方法及其半定量分析，屬于微生物發酵產物的測定與檢驗方法技術領域。

背景技術

紫杉醇(Taxol)為二萜類化合物，具有較為獨特的抗腫瘤機制，通過影響微管蛋白的穩定來抑制腫瘤細胞的分裂和增殖。但是紫杉醇作為重要的天然抗癌藥物，藥源問題一直未得到有效解決。直到現在，商業用紫杉醇主要提取自紅豆杉屬植物的樹皮，紅豆杉是世界性的瀕危珍稀植物，而且紫杉醇在紅豆杉樹皮內的含量極低，結果導致紫杉醇的供需矛盾突出。為了在不破會自然資源的情況下有效解決紫杉醇的藥源問題，各國學者主要從三個方面開展研究工作。

一是紫杉醇的化學合成。盡管全合成或半合成紫杉醇的研究均已經取得積極進展，但是合成步驟太多，合成條件難以控制，產物收率偏低，并不適于工業化生產；

二是紅豆杉的組織培養和細胞培養。期望通過生物反應器實現大規模培養并最終獲取目的產物，但是紅豆杉細胞容易褐化、培養物生物量小，培養規模小、紫杉醇產率較低和生產穩定性差等問題并沒有得到徹底解決，距離真正實現紫杉醇工業化生產還有距離；

第三個是真菌發酵，通過微生物發酵的方法生產紫杉醇開創了解決紫杉醇藥源問題的新思路。由于真菌生長迅速、容易培養、發酵技術相當成熟，未來通過真菌發酵解決紫杉醇的藥源問題無疑是最誘人的辦法和途徑。目前面臨的最大問題，就是菌株的紫杉醇生產能力與發酵生產的要求還有很大距離；盡管紫杉醇產生菌株具有廣泛的多樣性，但是當務之急還是從紅豆杉植物中大量篩查內生真菌，獲得優良的紫杉醇產生菌株，為紫杉醇的發酵生產提供豐富的真菌資源。

薄層層析法是一種微量、快速而簡單的色譜方法，兼具柱色譜和紙色譜等分析方法的優點，廣泛應用于發酵產物、環境化學、高分子材料以及石油化工等技術領域。借助薄層層析顯色反應，建立成熟的紫杉醇產生菌株的快速篩選方法、并對菌株的紫杉醇生產能力進行半定量分析具有積極意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種重現性好、靈敏度高、可以從紅豆杉內生真菌中篩選到紫杉醇菌株并對紫杉醇菌株產量進行半定量分析。

實現本發明目的采取的技術方案如下：

（1）真菌發酵產物的制備：選取若干紅豆杉植物的組織塊進行表面消毒，分離內生真菌純培養物；將得到的菌株充分活化，轉接入50mL種子培養基，22℃、130?rpm/min，恒溫振蕩培養3天獲得發酵種子；以20%（體積比）接種量，轉接100mL發酵培養基，22℃，110?rpm/min，恒溫振蕩培養15天后完成發酵；過濾內生真菌的發酵產物，濾液用等體積的氯仿-甲醇液(10/1，體積比)萃取2次，收集有機相，即真菌發酵產物的萃取物；

（2）紫杉醇標準溶液的配制：稱取紫杉醇標準品2mg，溶解于10mL三氯甲烷，配制成0.2?mg/mL標準溶液；

（3）薄層層析與顯色反應：稱取10g硅膠，加入無菌蒸餾水后充分攪勻，濕法鋪板，110℃烘干活化0.5?小時，制成硅膠板，置于干燥器內備用；層析時，點樣于硅膠板上，使用氯仿-甲醇液(7/1，體積比)作為展開劑直立上行展開，層析完成后將層析板取出揮干，使用含有1-3wt%香草醛的濃硫酸液噴霧顯色；

（4）紫杉醇菌株的篩選：將步驟（1）得到的真菌發酵產物的萃取物和步驟（2）的紫杉醇標準溶液同時點樣于硅膠板上的不同位置，在展開缸內進行如步驟（3）中薄層層析和顯色反應，萃取物在層析板上如果形成與標準溶液遷移率(Rf)相同的藍色斑點，即確認該內生真菌可以產生紫杉醇；

（5）真菌菌株紫杉醇產量的半定量分析：將步驟（2）配制好的0.2?mg/mL紫杉醇標準溶液，使用微量進樣器分別吸取5、25、45、65、85?μL，點樣于硅膠板上，在展開缸內進行如步驟（3）中薄層層析和顯色反應，由于點樣的標準液中紫杉醇含量不同，顯色后形成的藍色斑點深淺不同；將分離的紫杉醇菌株進行如步驟（3）中薄層層析和顯色反應，根據藍色斑點的深淺變化，對比標準溶液形成的藍色斑點，可以實現對菌株的紫杉醇產量進行半定量分析。

本發明進一步的設置如下：

步驟1中：所述的分離紅豆杉內生真菌的方法為將植物組織塊連續浸入75%（體積比）乙醇中1分鐘，3.25wt%次氯酸鈉中5分鐘，75%（體積比）乙醇中30秒鐘，然后用無菌濾紙吸干，將處理后的組織塊放在加有鏈霉素（30mg/L）的PDA（馬鈴薯瓊脂培養基）平板上，封口后25℃恒溫培養2個月，通過尖端菌絲挑取法將菌落轉移到PDA斜面保存。

步驟1中：所述的種子培養基和發酵培養基為改良的馬丁氏液體培養基。