[發明專利]一種紫杉醇菌株的篩選方法及其半定量分析

無效

• 申請號: 201210249811.6
• 申請日: 2012-07-19
• 公開（公告）號: CN102796800A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 臧威;孫劍秋;范呈浪;尹軍霞;沈國娟
• 申請（專利權）人: 紹興文理學院
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;G01N30/90
• 代理公司: 紹興市越興專利事務所 33220
• 代理人: 王余糧

1.一種紫杉醇菌株的篩選方法及其半定量分析，包括紫杉醇標準溶液的配制、真菌發酵產物的制備，其特征在于：還包括薄層層析與顯色反應、紫杉醇菌株的篩選和菌株紫杉醇產量的半定量分析，

（1）真菌發酵產物的制備：選取若干紅豆杉植物的組織塊進行表面消毒，分離內生真菌純培養物；將得到的菌株充分活化，轉接入50mL種子培養基，22℃、130?rpm/min，恒溫振蕩培養3天獲得發酵種子；以20%（體積比）接種量，轉接100mL發酵培養基，22℃，110?rpm/min，恒溫振蕩培養15天后完成發酵；過濾內生真菌的發酵產物，濾液用等體積的氯仿-甲醇液(10/1，體積比)萃取2次，收集有機相，即真菌發酵產物的萃取物；

（2）紫杉醇標準溶液的配制：稱取紫杉醇標準品2mg，溶解于10mL三氯甲烷，配制成0.2?mg/mL標準溶液；

（3）薄層層析與顯色反應：稱取10g硅膠，加入無菌蒸餾水后充分攪勻，濕法鋪板，110℃烘干活化0.5?小時，制成硅膠板，置于干燥器內備用；層析時，點樣于硅膠板上，使用氯仿-甲醇液(7/1，體積比)作為展開劑直立上行展開，層析完成后將層析板取出稍微揮干，使用含有1-3wt%香草醛的濃硫酸液噴霧顯色；

（4）紫杉醇菌株的篩選：將步驟（1）得到的真菌發酵產物的萃取物和步驟（2）的紫杉醇標準溶液同時點樣于硅膠板，在展開缸內進行如步驟（3）中薄層層析和顯色反應，萃取物在層析板上如果形成與標準溶液遷移率(Rf)相同的藍色斑點，即確認為該內生真菌可以產生紫杉醇；

（5）真菌菌株紫杉醇產量的半定量分析：將步驟（2）配制好的0.2?mg/mL紫杉醇標準溶液，使用微量進樣器分別吸取5、25、45、65、85?μL，點樣于硅膠板上，在展開缸內進行如步驟（3）中薄層層析和顯色反應，形成深淺不同的藍色斑點。

2.將紫杉醇菌株發酵產物的萃取物進行如步驟（3）中薄層層析和顯色反應，并與標準溶液形成的藍色斑點對比，對菌株的紫杉醇產量進行半定量分析。

3.根據權利要求1所述的一種紫杉醇菌株的篩選方法及其半定量分析，其特征在于：步驟1中，所述的分離紅豆杉內生真菌的方法為將植物組織塊連續浸入75%乙醇中1分鐘，3.25%次氯酸鈉中5分鐘，75%乙醇中30秒鐘，然后用無菌濾紙吸干，將處理后的組織塊放在加有鏈霉素（30mg/L）的PDA（馬鈴薯瓊脂培養基）平板上，封口后25℃恒溫培養2個月，通過尖端菌絲挑取法將菌落轉移到PDA斜面保存。

4.根據權利要求1所述的一種紫杉醇菌株的篩選方法及其半定量分析，其特征在于：步驟1中，所述的種子培養基和發酵培養基為改良的馬丁氏液體培養基。

5.根據權利要求1所述的一種紫杉醇菌株的篩選方法及其半定量分析，其特征在于：步驟3中，所述的濃硫酸液中香草醛的含量為1wt%。

6.根據權利要求3所述的一種紫杉醇菌株的篩選方法及其半定量分析，其特征在于：所述的改良的馬丁氏液體培養基成分為葡萄糖?10g/L，蛋白胨?5g/L、KH₂PO₄?1g/L，MgSO₄·7H₂O?0.5g/L，苯丙氨酸?2.8mg/L，苯甲酸鈉?30mg/L，乙酸鈉?1g/L，pH為5.5-6.0。