[發(fā)明專利]包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210248240.4
• 申請日: 2012-07-18
• 公開（公告）號: CN102764442A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發(fā)明（設計）人: 袁偉恩;金拓;吳飛;葛雪梅;張奇昕;蔡云鵬;段詩悅
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K47/42;A61K47/36;A61K47/34;A61K9/14;C08G81/00;C08B37/02;C08G63/08;C08G63/91
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 胡晶

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，特別涉及一種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的制備方法。

技術背景

siRNA是一段21－25個堿基對的RNA分子，發(fā)現于單細胞生物抵御病毒侵襲的機制。單細胞生物針對入侵病毒的mRNA序列合成出一段與之互補的siRNA，主動結合mRNA，從而阻斷病毒的復制。siRNA因其獨特的靶點特異性、結構可設計性和代謝安全性，成為科研界普遍看好的新的治療藥物。然而，在過去的20年里，研究人員設計了一系列的載體用于siRNA的體內輸送，但僅有極少數進入臨床階段，迄今，仍未有一個載體得到FDA認證，一個有效載體的缺位，導致核酸物質體內輸送仍然處于臨床瓶頸期。

將核酸物質輸送到靶細胞的胞漿或細胞核內，需要克服一系列的體內輸送屏障，因此，核酸載體是否高效，是其能否用于臨床治療的關鍵所在。核酸物質輸送的載體一般為以下兩類：（1）病毒載體：病毒載體（如慢病毒載體、腺病毒載體）作為基因的輸送載體，雖然有較高的體外轉染活性，然而，其免疫原性與易導致突變的缺點為臨床試驗帶來了巨大的安全問題，使得其應用受限。（2）非病毒載體：非病毒載體的優(yōu)勢主要在于，在保證預期的轉染活性的條件下，可以大大降低病毒載體所帶來的免疫原性與諸多炎癥反應，其一般為以下兩種載體設計：(a)陽離子脂質體；(b)聚陽離子基因載體。而目前研究更多的主要集中于聚陽離子基因載體與陽離子脂質體的修飾，使之適用于基因物質的靶向輸送。陽離子脂質體具有較高的體內外轉染活性，然而，由于表面的正電荷影響其體內的正常分布，同時，由于選用陽離子脂質，免疫原性與炎癥反應在動物試驗中也成為不可避免的缺點之一（Gao,K.&Huang,L.Nonviral?methods?for?siRNA?delivery.Molecular?pharmaceutics6,651-658(2008).）。

魚精蛋白，是一種天然的富含多精氨酸結構的多肽，表面帶有正電荷，可通過靜電作用力壓縮核酸物質至納米尺度。目前，魚精蛋白已經用于高效的體內、體外的基因輸送載體。其優(yōu)勢在于，血漿敏感度低，在低質量比時，無免疫原性，低毒，成為基因輸送的優(yōu)良載體。然而，存在的一個問題是，沒有經過修飾的魚精蛋白基因顆粒，會產生一定的非靶組織粘附，同時，其血液半衰期也較低，易被血漿清除。鑒于此，諸多文獻中報道，可選用魚精蛋白與陽離子脂質體對DNA或者siRNA進行壓縮包封，即LPD-Ⅰ(lipopolyplexes),并在表面接枝PEG以及靶向基團，以延長體內循環(huán)時間，并提高靶向效率。但由于選用非天然的陽離子脂質，存在體內毒性與體內免疫原性等問題，同時，未能中和的陽離子表面的正電荷會引起體內非靶組織的粘附，并與血漿成分發(fā)生聚集，從而降低靶向效果，并直接影響體內病變細胞的內吞。

發(fā)明內容

本發(fā)明目的在于提供一種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的制備方法，以解決現有的以魚精蛋白與陽離子脂質體對DNA或者siRNA進行壓縮包封得到的納米顆粒，由于選用非天然的陽離子脂質，存在體內毒性和體內免疫原性的問題，并且，未能中和的陽離子表面的正電荷從而引起體內非靶組織的粘附，并與血漿成分發(fā)生聚集，從而降低靶向效果，并直接影響體內病變細胞的內吞的技術性問題。

本發(fā)明目的通過以下技術方案實現：

一種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）以PEG為連續(xù)相制備親水相系統(tǒng)；

2）將嵌段高分子、魚精蛋白和基因物質加入步驟1）所制備的親水相系統(tǒng)中，攪拌或搖動，形成納米顆粒；

3）用透析袋透析除去所述納米顆粒水相中留存的PEG，即可制得包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒。

優(yōu)選地，所述親水相系統(tǒng)中PEG的濃度為0.1~20wt%。

優(yōu)選地，所述基因物質與所述魚精蛋白的質量之和與所述嵌段高分子質量之比為1：0.1~1000，所述基因物質與所述魚精蛋白的質量比為0.1~100：1。

優(yōu)選地，所述透析袋的截留分子量為5000~20000Da，透析時間為6~72h。

優(yōu)選地，所述嵌段高分子包括依次連接的第一嵌段、第二嵌段和第三嵌段，所述第一嵌段和所述第三嵌段為親水嵌段，所述第二嵌段為疏水嵌段。

優(yōu)選地，所述第一嵌段可選自PEG或PEO。

優(yōu)選地，所述第二嵌段可選自聚乳酸、聚乙交酯、聚乙交酯-丙交酯共聚物或聚己內酯中的一種。

優(yōu)選地，所述第三嵌段包括蛋白親和作用力強的高分子，所述蛋白親和作用力強的高分子選自葡聚糖、麥芽糖或殼聚糖中的一種。