[發(fā)明專利]一種芹菜EST-SSR指紋圖譜構(gòu)建方法及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210246973.4
• 申請日: 2012-07-17
• 公開（公告）號: CN102719554A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蘭青闊;王永;趙新;陳銳;朱珠;李歐靜;徐石勇;郭永澤
• 申請（專利權(quán)）人: 天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)的蔬菜分子輔助育種與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及芹菜EST-SSR指紋圖譜的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，是一種基于EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)的分析。

背景技術(shù)

芹菜，屬傘形科植物。有水芹、旱芹兩種，功能相近，藥用以旱芹為佳。旱芹香氣較濃，又名“香芹，亦稱藥芹。芹菜含有豐富蛋白質(zhì)、胡蘿卜素、碳水化合物、脂肪、B族維生素、維生素C、糖類、氨基酸及礦物質(zhì)和膳食纖，其中磷和鈣的含量較高。芹菜是高纖維食物,它經(jīng)腸內(nèi)消化作用產(chǎn)生一種木質(zhì)素或腸內(nèi)脂的物質(zhì)，這類物質(zhì)是一種抗氧化劑，常吃芹菜，尤其是吃芹菜葉，對預(yù)防高血壓、動脈硬化等都十分有益，并有輔助治療作用。

芹菜是一年或兩年生草本植物，株高約50～80厘米。莖一般都在手指粗細(xì)，中間為空。根呈須狀。葉為羽狀復(fù)葉卵形。花白色。芹菜每年六月開始播種，一星期左右就可出苗，經(jīng)過六十天左右生長，就可以食用。芹菜的開花期為七月至十一月，花朵細(xì)小呈白色，里面可找到種子。芹菜耐寒不喜高溫，最佳溫度在15到20攝氏度之間為佳。

芹菜品種間形態(tài)特征差異極小，從植物學(xué)上較難區(qū)分，且易受到環(huán)境和人為因素影響;再加上芹菜為二年生蔬菜，生長期長，進(jìn)行芹菜優(yōu)良性狀早期鑒定和遺傳關(guān)系研究十分必要。通過分子標(biāo)記對芹菜進(jìn)行早期選擇、預(yù)測，將會大大加速育種進(jìn)程，縮短育種年限，同時某些不易區(qū)分的性狀也將通過遺傳標(biāo)記的間接選擇達(dá)到目的。利用遺傳圖，把優(yōu)良基因，如雄性不育基因、抗病基因等分離出來都將會為芹菜遺傳育種增加更為豐富的品系。

和其它類型分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記具有共顯性、多態(tài)性高、實驗程序簡單等優(yōu)點，是目前遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)研究中最常用的標(biāo)記之一。目前開發(fā)的SSR標(biāo)記主要有基因組SSR和EST-SSR兩類。基因組SSR引物的開發(fā)通常需要構(gòu)建基因組文庫，花費大，效率低。隨著大量表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)的出現(xiàn)，對于許多植物而言，利用EST數(shù)據(jù)庫開發(fā)SSR引物是一項高效、低花費的選擇。另外，由于部分EST-SSR標(biāo)記來自于基因的編碼區(qū)，所以更容易獲得基因表達(dá)的信息，可為功能基因的直接鑒定提供重要依據(jù)。

目前EST-SSR標(biāo)記已被用于小麥(Eujayletal.,2001)、玉米(Wang?and?Bowen,?1998)、大麥(Kota?et?al.,?2001;Thiel?et?al.,?2003)、甘蔗(Cordeiro?et?al.,?2001)、葡萄(Scott?et?al.,?2001)等的遺傳作圖(Kota?et?al.,?2001)、遺傳多樣性(Eujayl?et?al.,?2001)、基因發(fā)掘(Remington?et?al.,?2001;?Vigouroux?et?al.,?2002)等研究。但關(guān)于標(biāo)記芹菜EST-SSR指紋圖譜的構(gòu)建尚未見文獻(xiàn)報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于公開了一種芹菜EST-SSR指紋圖譜構(gòu)建方法及其應(yīng)用，為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

一種芹菜EST-SSR指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于包括候選EST-SSR位點搜尋、驗證、EST-SSR位點分析及指紋圖譜構(gòu)建步驟：

（1）候選EST-SSR位點搜尋：以芹菜英文名或拉丁文名或別稱為關(guān)鍵詞查詢GenBank數(shù)據(jù)庫公布的芹菜EST序列，利用BatchPrimer3?v1.0在線軟件掃描分析EST序列中候選EST-SSR位點信息，并設(shè)計每個候選EST-SSR位點PCR擴增引物，包括上游引物和下游引物；

（2）候選EST-SSR位點驗證：以芹菜基因組DNA為模板，每個位點經(jīng)過PCR擴增、聚丙烯酰胺凝膠電泳，篩選出多態(tài)性較強的EST-SSR位點；

其中的PCR擴增反應(yīng)的總體積為10?μL，擴增反應(yīng)體系為：2×GoTaq??Master?Mixes?5?μL，10μmol/L上游和下游引物各0.25μL；50?ng/μL的芹菜基因組DNA模板1μL，雙蒸水補足10?μL；PCR反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性5?min，35個擴增循環(huán)（94℃?30?sec，50℃?30?sec，72℃?30?sec）；72℃延伸7?min，4℃保存；