[發(fā)明專利]一種芹菜EST-SSR指紋圖譜構(gòu)建方法及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210246973.4
• 申請日: 2012-07-17
• 公開（公告）號: CN102719554A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘭青闊;王永;趙新;陳銳;朱珠;李歐靜;徐石勇;郭永澤
• 申請（專利權(quán)）人: 天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

1.一種芹菜EST-SSR指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于包括候選EST-SSR位點(diǎn)搜尋、驗(yàn)證、EST-SSR位點(diǎn)分析及指紋圖譜構(gòu)建步驟：

（1）候選EST-SSR位點(diǎn)搜尋：以芹菜英文名或拉丁文名或別稱為關(guān)鍵詞查詢GenBank數(shù)據(jù)庫公布的芹菜EST序列，利用BatchPrimer3?v1.0在線軟件掃描分析EST序列中候選EST-SSR位點(diǎn)信息，并設(shè)計(jì)每個(gè)候選EST-SSR位點(diǎn)PCR擴(kuò)增引物，包括上游引物和下游引物；

（2）候選EST-SSR位點(diǎn)驗(yàn)證：以芹菜基因組DNA為模板，每個(gè)位點(diǎn)經(jīng)過PCR擴(kuò)增、聚丙烯酰胺凝膠電泳，篩選出多態(tài)性較強(qiáng)的EST-SSR位點(diǎn)；

其中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為10?μL，擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2×GoTaq??Master?Mixes?5?μL，10μmol/L上游和下游引物各0.25μL；50?ng/μL的芹菜基因組DNA模板1μL，雙蒸水補(bǔ)足10?μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5?min，35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（94℃?30?sec，50℃?30?sec，72℃?30?sec）；72℃延伸7?min，4℃保存；

其中的聚丙烯酰胺凝膠電泳條件為：濃度為8%，凝膠組分為：去離子水21?mL，10×TBE?3?mL，40%?PAG（聚丙烯酰胺）?6?mL，TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）?30μL，10%?過硫酸銨?300μL；設(shè)定電壓?250V，電泳?1h，關(guān)閉電源，進(jìn)行染色；染色過程：固定液中浸泡5-10min，硝酸銀染色液銀染8～10?min，迅速水洗，顯色液顯色數(shù)分鐘，直至條帶清晰即可，再次水洗；顯色結(jié)束后，將凝膠放入成像系統(tǒng)拍照獲取譜帶信息；比較同一EST-SSR位點(diǎn)在不同芹菜品種中的多態(tài)性；具有多態(tài)性的候選EST-SSR位點(diǎn)確認(rèn)為芹菜EST-SSR位點(diǎn)；

（3）EST-SSR位點(diǎn)分析及指紋圖譜構(gòu)建：將電泳圖片導(dǎo)入GeneTools（Sygene）軟件，定義分子量Marker，對目標(biāo)條帶進(jìn)行條帶分子量分析；構(gòu)建基于EXCEL數(shù)據(jù)格式的EST-SSR指紋圖譜，記錄目標(biāo)條帶分子量大小，在有條帶處記作×或者1，不條帶處不記錄或者記作0。

2.采用權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法構(gòu)建芹菜EST-SSR指紋圖譜，其特征在于包括8個(gè)EST-SSR位點(diǎn)信息、PCR擴(kuò)增引物、11個(gè)芹菜育種材料的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜和基于EXCEL格式的指紋圖譜：

（1）8個(gè)芹菜EST-SSR位點(diǎn)及其PCR擴(kuò)增引物：

（2）以11份芹菜育種材料DNA為模板，8對芹菜EST-SSR引物分別PCR擴(kuò)增及聚丙烯凝膠電泳結(jié)果，見圖1；

（3）一套基于EXCEL數(shù)據(jù)格式的芹菜EST-SSR指紋圖譜，包括11份芹菜育種材料的8個(gè)EST-SSR位點(diǎn)結(jié)果，見表2：

表2???11個(gè)芹菜育種材料的8個(gè)EST-SSR位點(diǎn)指紋圖譜：

?

?

?其中，條帶代表聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶分子量大小，以bp為單位；Band代表?xiàng)l帶數(shù)量；S1~S11代表11個(gè)芹菜育種材料樣品。