[發明專利]一種結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗的制備方法

無效

• 申請號: 201210246838.X
• 申請日: 2012-07-17
• 公開（公告）號: CN102784389A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 姜燕
• 申請（專利權）人: 沈陽大學
• 主分類號: A61K39/04
• 分類號: A61K39/04;A61K9/127;A61P31/06;C12N15/31;C12N15/79
• 代理公司: 沈陽技聯專利代理有限公司 21205
• 代理人: 趙越

技術領域

本發明涉及一種疫苗的制備方法，特別是涉及一種結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗的制備方法。?

背景技術

近年來隨著人口流動增加,艾滋病蔓延以及新型結核菌株，多重耐藥菌株的出現，結核病一改過去逐年遞減的趨勢，發生回潮，病例數明顯增加，發病率以每年20%的速度遞增，成為死亡率最高的感染性疾病。因此預防接種對結核病的控制和消滅起著關鍵性的作用。?

目前預防接種防治結核病以卡介苗(BCG)作為唯一臨床使用的疫苗，預防效果并不穩定。BCG是由一株患結核性乳腺炎的奶牛身上分離到的牛型結核分支桿菌，經過230次連續傳代減毒而失去了一些編碼具有免疫保護作用的抗原基因。同時BCG的接種會使結核菌素試驗陽性，對結核病的診斷產生干擾，延誤治療時間，因此研制新疫苗成為當前結核病防治的首要任務。?

口服疫苗不但能有效地誘導膜系統的特異性免疫力，而且口服給藥的途徑簡單、安全，避免了注射疫苗所需要的嚴格標準，不需高度專業訓練的衛生人員即可同時開展大量人群的免疫，因此口服DNA疫苗是一種易于普遍接受的疫苗接種形式。本發明選用目的抗原基因為Ag85A,相對分子質量為32?KD,存在于結核桿菌和BCG?的細胞壁及培養濾液中,可顯著刺激細胞免疫功能增強。本發明涉及重組真核表達質粒pCDNA3.1+/Ag85A的構建，其編碼蛋白可在腸粘膜、脾和淋巴結等處表達，可明顯刺激全身性的細胞免疫和體液免疫應答，如細胞毒活性和特異性IgG抗體產生，還可以使腸粘膜局部產生特異性分泌型IgA，可極大增強免疫應答，而經注射途徑不能誘導此種分泌型IgA的分泌。以往單純應用裸DNA疫苗存在極大缺陷，經口服攝入在胃腸道內穩定性差，而且胃腸粘膜對抗原遞呈產生的免疫應答較弱，所以口服免疫所需的抗原量大，這就限制了口服疫苗的應用。本發明選用脂質體為運載體包裹口服疫苗，防止降解，有效的誘導機體產生免疫應答，同時脂質體可用作疫苗的保護劑，可防止核酸被體內物質降解，可將其特異性傳遞到靶細胞中；無毒、無免疫性，具有生物惰性，可生物降解；易于制備，使用方便，可將大的DNA片斷轉運到細胞中；基因轉染率高，100％離體細胞可以瞬間表達外源基因。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗的制備方法，以脂質體為運載體的結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗具備穩定表達目的蛋白的免疫預防效果，由于脂質體的運載達到無毒無干擾的安全口服要求，可顯著刺激細胞免疫功能增強，為口服DNA疫苗的臨床應用研究奠定基礎。?

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：?

一種結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗的制備方法，其所述方法包括重組真核表達質粒pCDNA3.1+/Ag85A的構建、薄膜分散法制備脂質體、脂質體為運載體的結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗的制備，具體過程為：重組真核表達質粒pCDNA3.1+/Ag85A的構建包括引物設計、結核分支桿菌H37Rv株接種改良羅氏培養基、聚合酶鏈式反應擴增Ag85A基因、純化聚合酶鏈式反應產物TA克隆入載體pUCm-T?載體、藍白斑篩選、亞克隆入真核表達載體pCDNA3.1+鑒定正確后將重組質粒轉化感受態大腸桿菌菌株DH5α，構建重組真核表達質粒pCDNA3.1+/Ag85A，從受體菌DH?5α中提取純化pUCm-Ag85A，堿變性方法提取重組真核表達質粒pCDNA3.1+/Ag85A；薄膜分散法制備脂質體包括磷酸鹽緩沖液的配制及得到脂質體；脂質體為運載體的結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗的制備包括將溶液1.5毫升加入5毫升離心管中，同時加入1.5毫升的重組真核表達質粒pCDNA3.1+/Ag85A,將5毫升離心管置于漩渦混合器充分混合震搖?5分鐘后放入4?℃冰箱靜置2小時?,使成均勻的?DNA?脂質體混懸液,取出5毫升離心管，充氮氣后用膠塞密閉置于4?℃冰箱保存備用，此離心管中的混懸液即為結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗。

所述的一種結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗的制備方法，其所述結核分支桿菌H37Rv株接種改良羅氏培養基，為37℃培養8周，小量抽提DNA為模板；聚合酶鏈式反應擴增Ag85A基因；為94℃預變性15分鐘,熱啟動后轉入94℃變性1分鐘，60℃退火1.5分鐘,72℃延伸2分鐘，進行30個循環，72℃延伸10分鐘后終止反應，反應結束后取5微升產物于1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定正確后采用膠回收試劑盒純化聚合酶鏈式反應產物。?