[發明專利]一種結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗的制備方法

無效

• 申請號: 201210246838.X
• 申請日: 2012-07-17
• 公開（公告）號: CN102784389A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 姜燕
• 申請（專利權）人: 沈陽大學
• 主分類號: A61K39/04
• 分類號: A61K39/04;A61K9/127;A61P31/06;C12N15/31;C12N15/79
• 代理公司: 沈陽技聯專利代理有限公司 21205
• 代理人: 趙越

1.一種結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗的制備方法，其特征在于，所述方法包括重組真核表達質粒pCDNA3.1+/Ag85A的構建、薄膜分散法制備脂質體、脂質體為運載體的結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗的制備，具體過程為：重組真核表達質粒pCDNA3.1+/Ag85A的構建包括引物設計、結核分支桿菌H37Rv株接種改良羅氏培養基、聚合酶鏈式反應擴增Ag85A基因、純化聚合酶鏈式反應產物TA克隆入載體pUCm-T?載體、藍白斑篩選、亞克隆入真核表達載體pCDNA3.1+鑒定正確后將重組質粒轉化感受態大腸桿菌菌株DH5α，構建重組真核表達質粒pCDNA3.1+/Ag85A，從受體菌DH?5α中提取純化pUCm-Ag85A，堿變性方法提取重組真核表達質粒pCDNA3.1+/Ag85A；薄膜分散法制備脂質體包括磷酸鹽緩沖液的配制及得到脂質體；脂質體為運載體的結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗的制備包括將溶液1.5毫升加入5毫升離心管中，同時加入1.5毫升的重組真核表達質粒pCDNA3.1+/Ag85A,將5毫升離心管置于漩渦混合器充分混合震搖?5分鐘后放入4?℃冰箱靜置2小時?,使成均勻的?DNA?脂質體混懸液,取出5毫升離心管，充氮氣后用膠塞密閉置于4?℃冰箱保存備用，此離心管中的混懸液即為結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗。

2.根據權利要求1所述的一種結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗的制備方法，其特征在于，所述結核分支桿菌H37Rv株接種改良羅氏培養基，為37℃培養8周，小量抽提DNA為模板；聚合酶鏈式反應擴增Ag85A基因；為94℃預變性15分鐘,熱啟動后轉入94℃變性1分鐘，60℃退火1.5分鐘,72℃延伸2分鐘，進行30個循環，72℃延伸10分鐘后終止反應，反應結束后取5微升產物于1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定正確后采用膠回收試劑盒純化聚合酶鏈式反應產物。

3.根據權利要求1所述的一種結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗的制備方法，其特征在于，所述純化聚合酶鏈式反應產物TA克隆入載體pUCm-T?載體：按pUCm-T?載體PCR擴增試劑盒建立反應體系：10x緩沖液?1微升,?pUCm-T?載體1微升?,?聚合酶鏈式反應產物3微升,T4?DNA連接酶1微升，加雙蒸水至10微升,25?℃連接30分鐘；連接產物轉化到受體菌DH?5a感受態細胞，取100微升轉化后的菌液鋪于10毫升含600微克氨芐青霉素、800微克IPTG、80微克X-gal的肉湯蛋白胨瓊脂平板，平放30分鐘后，37℃倒置培養12-16小時；藍白斑篩選：待藍色充分顯現，挑取白色菌落于10毫升含600微克氨芐青霉素的肉湯蛋白胨培養基，于37℃水浴鍋中以200?轉/分鐘速度振搖培養過夜，并擴增氨芐青霉素抗性克隆，質粒提取試劑盒小量抽提質粒。

4.根據權利要求1所述的一種結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗的制備方法，其特征在于，所述受體菌DH?5α中提取純化pUCm-Ag85A，經限制性內切酶XhoⅠ及BamHⅠ雙酶切，回收小片段作為目的基因，將其亞克隆入真核表達載體pCDNA3.1+同樣經XhoⅠ及BamHⅠ雙酶切后所回收的大片段；連接反應體系：載體1微升?，目的基因4微升，10x緩沖液?1微升,?T4?DNA連接酶1微升，加雙蒸水至10微升,?4℃過夜；第二天取連接產物轉化到受體菌DH?5a感受態細胞，挑取陽性克隆，抽提質粒行雙酶切及測序鑒定；堿變性方法提取重組真核表達質粒pCDNA3.1+/Ag85A,將所得質粒保存于pH8.0?Tris鹽酸緩沖液，使其終濃度為250微克/?毫升。

5.根據權利要求1所述的一種結核分支桿菌Ag85A口服DNA疫苗的制備方法，其特征在于，所述薄膜分散法制備脂質體包括：

（1）磷酸鹽緩沖液的配制：稱取磷酸氫二鈉0.37克與磷酸二氫鈉2.0克；加蒸餾水溶解并稀釋至1000毫升,調節該溶液PH值為5.7；

（2）稱取注射用豆磷脂0.9克、膽固醇0.3克；加入50ml容量的小燒杯中，加入無水乙醇2毫升，置于65～70℃水浴鍋中，用玻璃棒攪拌使豆磷脂及膽固醇充分溶解，旋轉該小燒杯使磷脂的乙醇液在杯壁上成膜，用吸耳球輕吹風，將乙醇揮發除去；

（3）將步驟二中第1點所述的磷酸鹽緩沖液30毫升加入小燒杯中并將小燒杯置于65～70℃水浴鍋中預熱，20分鐘后,將預熱的磷酸鹽緩沖液30毫升加入步驟二中第2點所制備的含有磷脂和膽固醇脂質膜的小燒杯中，?65～70℃水浴中攪拌水化10分鐘；隨后將小燒杯置于磁力攪拌器上，室溫下攪拌30分鐘，如果溶液體積減少，可補加水至30毫升，充分混勻，即可得到脂質體。