[發明專利]快速獲得葡萄松散型愈傷組織及其長期繼代保持的方法

無效

• 申請號: 201210246117.9
• 申請日: 2012-07-16
• 公開（公告）號: CN102763593A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 賴呈純;范麗華;謝鴻根;余亞白
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院農業工程技術研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 福州市鼓樓區京華專利事務所(普通合伙) 35212
• 代理人: 宋連梅

【技術領域】

本發明涉及植物組織培養技術領域，尤其涉及一種快速獲得葡萄松散型愈傷組織及其長期繼代保持的方法。

【背景技術】

葡萄(Vitis?vinifera?L.)，葡萄屬（Vitis）落葉藤本植物，幾乎占全世界水果產量的四分之一，其營養價值很高，可制成葡萄汁、葡萄干和葡萄酒。近年來，“法國悖論”的科學發現引起人們對葡萄中生物活性物質的廣泛關注。研究表明，葡萄中富含白藜蘆醇、兒茶素、表兒茶素和鞣花酸等酚類和類酚類生物活性物質，具有重要藥理功能和生物活性，具有良好的保健作用，尤其是白藜蘆醇具有抗癌的活性而受到市場的青睞。

隨著市場需求的不斷擴大，原有的從葡萄或其他替代植物中來源的生物活性物質已不能滿足需要。植物細胞培養是生物技術領域里的一個重要分支，因其具有生長速度快、周期短、不受季節影響、產物均一可控、藥效成分高于天然植物等優點，采用大規模植物細胞培養是解決藥用植物資源匱乏及藥效成分低的藥用植物滿足需求的重要途徑。近年來，植物細胞培養進行有效成分的生產已經取得了令人矚目的成就，而葡萄細胞培養生產次生代謝產物（如白藜蘆醇）的研究還處在實驗室的研究階段，進入中試和大規模培養還亟待解決如細胞株的篩選、細胞系的長期繼代保持、懸浮細胞系的建立和誘導子調控效率等諸多問題。為了解決這些問題，目前最關鍵的技術是建立快速獲得葡萄松散型愈傷組織及其長期繼代保持的方法，但目前葡萄自然來源的外植體由于容易受到污染率和消毒劑的影響，存在愈傷組織誘導效率低，形成愈傷組織質量差，不能長期繼代保持等問題，導致葡萄細胞培養生產次生代謝產物的研究進行緩慢。直至目前，以葡萄葉片、葉柄、莖段等為外植體進行愈傷組織誘導取得了一定的進展，但以無菌株系小苗莖段和葉片誘導愈傷組織，并進行繼代增殖以獲得松散型愈傷組織、及對該松散型愈傷組織長期繼代保持的方法還鮮有報道。

【發明內容】

本發明所要解決的技術問題在于提供一種快速獲得葡萄松散型愈傷組織的方法，并揭露了將所獲得的葡萄松散型愈傷組織進行保持的方法。

本發明是通過以下技術方案解決上述技術問題的：一種快速獲得葡萄松散型愈傷組織的方法，其包括如下步驟：

（1）葡萄無菌株系的獲得：選取經預處理后的當年生無病葡萄枝條的帶節莖段，之后將所選取的帶節莖段接種到附加0.1mg/L?NAA的1/2MS培養基上誘導產生葡萄無菌株系；其中預處理包含清洗、風干表面水分，并殺菌消毒；

（2）啟動培養：取步驟（1）所獲得的葡萄無菌株系的小苗，切取0.5cm莖段或切取0.5cm×0.5cm見方大小的葉片作為外植體，接著將該外植體接種至誘導愈傷組織的培養基中，并將該培養基置于培養室中培養，7天后可見愈傷組織形成，25~30天后長成初代愈傷組織；

（3）制備葡萄松散型愈傷組織：將步驟（2）培養得到的初代愈傷組織轉接到繼代增殖培養基中，并將該繼代增殖培養基置于培養室中進行繼代增殖培養，以獲得葡萄松散型愈傷組織；

其中，步驟（2）與步驟（3）中所述培養室中的條件均為：溫度設置23~25℃，光照強度1500~2000lx，每天光照12h。

進一步地，步驟（2）中所述誘導愈傷組織的培養基為：MS+BA?2.0mg/L+NAA?0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L。

進一步地，步驟（3）中所述繼代增殖培養基為：MS+2,4-D?1.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L。

進一步地，揭露了上述所獲得的葡萄松散型愈傷組織長期繼代保持的方法，其操作如下：取上述步驟（3）所獲得的葡萄松散型愈傷組織，并接于第一種培養基中繼代保持至少2代后，轉接到第二種培養基中繼代保持1代，如此反復交替繼代培養，即可長期繼代保持葡萄松散型愈傷組織，且繼代保持時的該第一種培養基、第二種培養基均置于培養室中進行；其中，所述第一種培養基為：MS+2,4-D?1.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L；所述第二種培養基為：MS+2,4-D?1.0mg/L+KT?0.5mg/L+AgNO₃?5.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L；所述培養室中的條件為：溫度設置23~25℃，光照強度1500~2000lx，每天光照12h。