[發明專利]一種梅花染色體的熒光原位雜交方法

有效

• 申請號: 201210245928.7
• 申請日: 2012-07-16
• 公開（公告）號: CN102787166A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 張啟翔;陳晶鑫;楊冰潔;羅樂;楊煒茹
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，尤其涉及梅花染色體的熒光原位雜交方法。

背景技術

熒光原位雜交（Fluorescence?in?situ?hybridization）是20世紀80年代末發展起來的一種重要原位雜交方法，以非放射性熒光標記取代放射性同位素標記而形成的一種新的分子細胞遺傳學技術。目前，它是構建細胞遺傳圖譜最直接的方法之一，是研究DNA序列在染色體具體位置的最直接的方法，成為研究特定DNA序列與染色體區域相關聯的有效手段。該技術在許多科學研究領域都得到非常廣泛的應用，如DNA物理圖誘、染色體圖譜、細胞遺傳圖譜的構建、轉基因的細胞學鑒定、外源染色體片段的檢測、基因組結構的研究、物種間親緣關系的鑒定。

梅花（Prunus?mume）是我國重要的木本花卉，對梅花染色體研究是進行基因定位、構建物理圖譜的重要前提，為進一步選育優良品種、研究品種親緣關系、并為梅品種國際登錄和新品種保護提供分子水平品種鑒定技術。目前，關于梅花染色體的報道較少，僅限于利用壓片法或涂片法進行鏡檢觀察，根據染色體長短、大小以及長短臂進行核型分析?！睹坊―NA指紋圖譜的建立與研究》（明軍，2002，北京林業大學）是通過AFLP銀染反應體系對DNA進行分析，直觀表現品種間的相似程度，但其多態性條帶率與鑒別效率的相關性較低。

由于梅花屬于小染色體植物（野生種與栽培梅染色體數目及形態研究，包滿珠，1995），且染色體形態相似程度高，難以進行有效的核型分析。傳統的核型分析方法有其自身的局限性，對于染色體小、形態相似的植物，其精確性有待提高。因此，需要提高雜交的特異性和效率，以獲得良好的效果。不僅這樣，在FISH實驗過程中，由于固定方法或洗脫不完全，很容易導致非特異性雜交，產生假陽性；變性溫度和時間也是一個重要的影響因素，時間過短、溫度過低會造成雜交不完全，時間過長、溫度過高會使染色體斷裂丟失，造成雜交效率降低。因此，需要對FISH技術進行優化，使其很好地應用于梅花等小染色體植物。FISH技術在人類、動物以及少數植物中已成功運用，迄今為止，關于FISH技術在梅花中的應用未見報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種快速檢測梅花染色體的熒光原位雜交方法以應用于梅花染色體核型分析。

為達到上述目的，本發明提供以下技術方案：

以梅花中期染色體作為靶DNA，以玉米45SrDNA為探針進行梅花染色體熒光原位雜交。

具體地，包括以下步驟：

1）染色體玻片標本的制備與預處理；

2）探針標記與探針變性；

3）探針與染色體共變性；

4）雜交與雜交后洗脫；

5）信號檢測。

其中，步驟1）中所述染色體玻片標本的制備為以梅花莖尖為材料，采用去壁低滲火焰干燥法制備。

其中，步驟1）中所述預處理為將所述染色體玻片標本干燥，RNaseA、胃蛋白酶K處理，乙醇脫水。

其中，步驟2）中所述探針標記為將30-50ng/μl玉米45SrDNA質粒1-3份、DIG-Nick?translation?mix或Biotin-Nick?translation?mix?4份和ddH₂O?13-15份混合，10-15℃避光反應60-90min，加入EDTA?1份，得探針標記混合液。

優選地，玉米45SrDNA質粒為3份，ddH₂O為13份。

其中，步驟2）中所述探針變性為將所述探針標記混合液1-4份和10mg/ml鮭魚精溶液4份按體積比混合，60-65℃烘烤；加入50%去離子甲酰胺10份、20×SSC溶液2份、50%DS溶液4份，95℃避光變性10min，得變性探針。

優選地，探針標記混合液為2份。

其中，步驟3）中所述探針與染色體共變性為將變性后的探針加到染色體玻片標本上，共變性，變性溫度：85℃，變性時間：2-4min。

優選地，變性時間為3min。

其中，步驟4）中所述雜交為將所述共變性后的探針與色體玻片標本于37℃黑暗培養18-24h。

雜交液的成分按體積百含量為50%的去離子甲酰胺，20%的50%DS溶液，20%的10mg/ml鮭魚精溶液和探針混合液，10%的20×SSC溶液。

其中，步驟4）中所述雜交后洗脫為將雜交后的玻片依次放入2×SSC溶液，洗2×5min；放入2×SSC溶液，42℃恒溫10min；放入1×PBS溶液，洗5min。