[發明專利]一種梅花染色體的熒光原位雜交方法

有效

• 申請號: 201210245928.7
• 申請日: 2012-07-16
• 公開（公告）號: CN102787166A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 張啟翔;陳晶鑫;楊冰潔;羅樂;楊煒茹
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

1.一種梅花染色體的熒光原位雜交方法，其特征在于以梅花中期染色體作為靶DNA，以玉米45SrDNA為探針進行梅花染色體熒光原位雜交。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）染色體玻片標本的制備與預處理；

2）探針標記與探針變性；

3）探針與染色體共變性；

4）雜交與雜交后洗脫；

5）信號檢測。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟1）中所述染色體玻片標本的制備為以梅花莖尖為材料，采用去壁低滲火焰干燥法制備。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟1）中所述預處理為將所述染色體玻片標本干燥，RNaseA、胃蛋白酶K處理，乙醇脫水。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟2）中所述探針標記為將30-50ng/μl玉米45SrDNA質粒1-3份、DIG-Nick?translation?mix或Biotin-Nick?translation?mix?4份和ddH₂O?13-15份按體積比混合，10-15℃避光反應60-90min，加入EDTA?1份，得探針標記混合液，優選玉米45SrDNA質粒為3份，ddH₂O為13份。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2）中所述探針變性為將所述探針標記混合液1-4份和10mg/ml鮭魚精溶液4份按體積比混合，60-65℃烘烤；加入50%去離子甲酰胺10份、20×SSC溶液2份、50%DS溶液4份，95℃避光變性10min，得變性探針，優選探針標記混合液為2份。

7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟3）中所述探針與染色體共變性為將變性后的探針加到染色體玻片標本上，共變性，變性溫度：85℃，變性時間：2-4min，優選變性時間為3min。

8.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟4）中所述雜交為將共變性后的探針與染色體玻片標本于37℃黑暗培養18-24h。

9.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟4）中所述雜交后洗脫為將雜交后的染色體玻片標本依次放入2×SSC溶液，洗2×5min；放入2×SSC溶液，42℃恒溫10min；放入1×PBS溶液，洗5min。

10.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟5）中所述信號檢測為加2mg/ml?DAPI熒光染液于染色體玻片標本上，染色時間5-8min，進行檢測，優選染色時間5min。