[發明專利]噬菌體抗體庫的構建方法及應用此庫篩選到的抗CD6抗體

有效

• 申請號: 201210245760.X
• 申請日: 2012-07-16
• 公開（公告）號: CN102732974A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 劉方杰;周俊杰;尹琪;晏麗;扈艷紅;劉志剛;白先宏
• 申請（專利權）人: 百泰生物藥業有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12N15/13;C12N15/63;C07K16/28
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• 代理人: 暫無信息

1.一種天然人源Fab噬菌體抗體庫的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）構建噬菌體展示Fab抗體的噬粒載體PFK-1，PFL-6；

（2）人外周血淋巴細胞的分離及總RNA的提取，通過RT-PCR合成cDNA；

（3）以cDNA為模板，然后采用一組幾乎覆蓋人抗體全部重鏈或輕鏈可變區編碼序列的特異性引物進行PCR反應，擴增輕鏈kappa，lambda和重鏈可變區基因；

（4）將輕鏈kappa鏈和lambda鏈可變區基因分別與噬粒載體PFK-1，PFL-6連接，構建kappa鏈，lambda鏈輕鏈抗體庫；

（5）將重鏈VH片段基因與噬粒載體PFK-1連接，收集所有克隆質粒的DNA，構建重鏈抗體庫；

（6）將重鏈可變區基因從重鏈抗體庫DNA中切出，分別與輕鏈kappa庫DNA連接和輕鏈lambda庫DNA連接得到完整的抗體庫DNA；

（7）進行天然人源Fab噬菌體抗體庫的多樣性分析。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（3）中，一組幾乎覆蓋人抗體全部輕鏈可變區編碼序列的特異性引物如下所示：

擴增kappa輕鏈可變區基因的上游引物為：

5’VK-1?：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCAGACATCCAGWTGACCCA

5’VK-2：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCAGATGTTGTGATGACTCAG

5’VK-3：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCAGAAATTGTGWTGACRCA

5’VK-4：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCAGATATTGTGATGACCCAG

擴增kappa輕鏈可變區基因的下游引物為：

3’VK-1：

ACGTTTGATCTCGAGCTTGGTCCCYTGGCCRAA

3’VK-2：

ACGTTTGATCTCGAGTTTGGTCCCAGGGCCGAA

3’VK-3：

ACGTTTGATCTCGAGCTTGGTCCCTCCGCCGAA

擴增lambda輕鏈可變區基因的上游引物為:

5’VL-1?：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCACAGTCTGTGYTGACKCAG

5’VL-2：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCACARTCTGCCCTGACTCAG

5’VL-3：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCATCCTATGWGCTGACTCAG

5’VL-4：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCATCTTCTGAGCTGACTCAG

5’VL-5：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCACAGGCTGTGCTGACTCAG

5’VL-6：

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCAGCGCAAATTTTATGCTGACTCAGC

擴增lambda輕鏈可變區基因的下游引物為:

3’VL-1?：

CTTGGGCTGACCTAGGACGGTSACCTTGGTSCC

3’VL-2：

CTTGGGCTGACCTAGGACGGTCAGCTYSGTCCC

3’VL-3：

CTTGGGCTGACCTAGGATGATCAGCTGGGTTCC。