[發明專利]噬菌體抗體庫的構建方法及應用此庫篩選到的抗CD6抗體

有效

• 申請號: 201210245760.X
• 申請日: 2012-07-16
• 公開（公告）號: CN102732974A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 劉方杰;周俊杰;尹琪;晏麗;扈艷紅;劉志剛;白先宏
• 申請（專利權）人: 百泰生物藥業有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12N15/13;C12N15/63;C07K16/28
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及抗體工程技術領域，特別涉及一種噬菌體抗體庫的構建方法及此庫在抗體篩選中的作用，尤其涉及應用此庫篩選到的抗CD6抗體。

背景技術

抗體庫技術是90年代抗體工程領域的重大進展，它是噬菌體展示和抗體庫兩種技術的集成，它的出現有賴于PCR技術的建立、抗體分子在大腸桿菌的功能性表達以及噬菌體展示技術的發展。噬菌體抗體庫技術的原理就是將抗體分子的Fab或ScFv等片段與單鏈噬菌體外殼蛋白形成融合蛋白，展示于噬菌體顆粒表面。噬菌體抗體庫技術模擬了抗體免疫系統的選擇作用，呈現在噬菌體表面的抗體能夠在體外與固相化的靶抗原相互作用，然后反復洗滌去除非特異性結合抗體，再洗脫并收集與抗原結合的噬菌體，再次感染大腸桿菌，使特異的噬菌體得到富集。

建立噬菌體抗體庫的目的是為了有效的獲得針對各種抗原的人源抗體。抗體庫的篩選方法可分為：（1）液相抗原的篩選，可較好地保持抗原的天然構象；（2）完整細胞的篩選，適用于難以純化的或未知的抗原，但此法細胞膜成分復雜，難度較大；（3）組織篩選，用于一些難以獲得單個細胞的組織進行特異性抗體的篩選。噬菌體抗體庫將基因型和表型統一于一體，將選擇能力與擴增能力偶連起來，具有強大的篩選功能，能能夠在體外模擬體內的抗體生成過程，使抗體工程技術進入了一個新的時代。

目前，噬菌體抗體庫主要用于表達篩選Fab和單鏈抗體（ScFv）。Fab即抗原結合片段（fragment?of?antigen?binding）是由重鏈Fd段和完整輕鏈組成，是完整抗體分子的三分之一，在體內的穩定性要遠高于單鏈抗體，并且具有易于進行結構改造且細菌內表達產物多為有功能的抗體片段等優點，因此，Fab在研究抗體可變區的功能活性以及臨床應用有著不可比擬的優點。

治療性抗體的發展經歷了異源抗體、人源化抗體和人源性抗體幾個階段。目前，人源性抗體是治療性抗體發展的主要方向，而噬菌體抗體庫技術的出現為人源性抗體的制備提供了良好的技術平臺，并且逐漸成為目前獲得人源性抗體的主要手段之一。

抗CD6單克隆抗體在牛皮鮮及類風濕性關節炎等疾病的治療方面已經顯示了較好的治療效果，因此抗CD6單克隆抗體的篩選已經成為抗體領域的研究熱點。

CD6分子是I型跨膜糖蛋白，胞外區有3個富含半胱氨酸的功能區重復序列，屬于SRCRSF家族，CD6有105/110KD和130KD兩種異構型。CD6分子序列全長668個氨基酸，去除N-末端17個氨基酸信號肽序列后，CD6分子胞外區385個氨基酸，胞外區至少有3個表位:SRCR1、SRCR2和SRCR3。目前研究較多的CD6配體是ALCAM(CD166)。CD6/CD6L配體相互作用可能通過下列途徑調節T細胞活化：①通過PKC途徑激活T細胞。②CD6與CD6L粘附促進并延長T細胞與APC的接觸，從而延長了經TRC/CD3或CD2通路產生的刺激；③CD6交聯可以觸發細胞漿游離Ca²⁺濃度增加。

CD6參與T細胞的活化，發揮免疫效應，同時表明CD6也參與免疫自穩的功能。目前，對CD6在淋巴細胞的活化和分化中的準確機制還不是很清楚。但越來越多的研究表明CD6是T淋巴細胞活化的重要輔助分子，提供淋巴細胞活化的共刺激信號。基于CD6分子在淋巴細胞成熟、活化和增殖中的重要作用，阻斷CD6分子的功能可為類風濕性關節炎、銀屑病等自身免疫性疾病的治療提供新的治療手段和方法。

因此，為了滿足高通量篩選臨床治療用的低抗原性、高親和性抗體，構建具有高度多樣性、通用性好、無抗原偏向性的大容量天然人源Fab噬菌體抗體庫有著極其重要的應用價值。并且該抗體庫在如抗CD6抗體等人源化抗體的篩選方面具有重要的作用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種構建高度多樣性的大容量天然人源Fab噬菌體抗體庫的方法，以及應用此庫篩選出一株抗CD6抗原的單克隆抗體。該抗體庫主要用于高通量篩選臨床治療用的低抗原性和高親和性人源抗體。

本發明的技術方案如下：

一種天然人源Fab噬菌體抗體庫的構建方法，包括如下步驟：

（1）構建噬菌體展示Fab抗體的噬粒載體PFK-1，PFL-6；

（2）人外周血淋巴細胞的分離及總RNA的提取，通過RT-PCR合成cDNA；

（3）以cDNA為模板，采用一組幾乎覆蓋人抗體全部重鏈或輕鏈可變區編碼序列的特異性引物進行PCR反應，擴增輕鏈kappa，lambda和重鏈可變區基因；