[發明專利]一種豬肺炎支原體多重組抗原ELISA檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201210244908.8
• 申請日: 2012-07-13
• 公開（公告）號: CN102735851A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 劉茂軍;杜改梅;邵國青;韋艷娜;馮志新;白方方;熊祺琰
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術領域

本發明涉及一種動物傳染病檢測用試劑盒，屬于獸用生物制品領域。

背景技術

豬肺炎支原體（Mycoplasma?hyopneumoniae，Mhp）是引起豬支原體肺炎（Mycoplasmal?pneumoniae?of?swine，Mps又稱豬氣喘?。┑闹饕≡?，也是豬呼吸道疾病綜合癥的一種重要的原發性病原。Mhp主要感染豬呼吸道，本身致病力不強，臨床癥狀主要以咳嗽和氣喘為主，病變特征主要是肺的尖葉、心葉、中間葉和隔葉前緣呈“肉樣”或“蝦肉樣”實變。Mhp感染機體后主要與呼吸道內壁的纖毛黏附，引起纖毛細胞病變和凋亡，導致纖毛斷裂和脫落，引起機體發病，并且會嚴重影響豬的生長發育和飼料轉化率，或者破壞粘膜-纖毛屏障，容易繼發其他致病菌的感染（特別是對青年豬），提高致死率，因而給養豬業造成巨大的經濟損失。目前豬支原體肺炎的主要防治措施是疫苗和藥物，但由于缺乏有效的藥物，且疫苗免疫后僅能減輕患豬臨床癥狀的發生，降低死亡率，不能抵御機體對Mhp強毒的感染。因此，建立一種敏感、穩定的檢測方法對本病的檢測和監控及流行病學調查具有重要的意義。

目前，豬肺炎支原體的診斷技術主要有以下四種：臨床檢查、細菌學檢查、分子生物學檢查和血清學檢查。支原體體外培養比較復雜，Mhp的分離培養具有一定的難度，并且時間較長，容易漏檢，不適合于臨床應用。已有研究報道，通過PCR擴增特異性片段的方法來檢測，具有較好的效果，但通過呼吸道采集樣品，勢必會對豬只造成不同程度的影響，且PCR法有一定的技術要求，儀器設備要求較高，價格昂貴，不易于在生產實際中推廣應用。血清學檢測則可避免以上缺點。國內外建立了多種血清學檢測方法如免疫瓊擴、間接血凝等，免疫瓊擴、間接血凝試驗雖操作簡單，但存在敏感性不高的問題。ELISA方法操作簡單，敏感性高，特異性好，可作為檢測的有效手段，并可在基層得到廣泛應用。目前，國內外均有相關研究報道，國外雖已研制成了ELISA檢測試劑盒，但檢出率低，且價格較為昂貴。因此，建立一種適用的、特異性好的、穩定性高的Mhp?ELISA檢測手段是目前有效控制該病發生的關鍵。

本病全球性分布，國外遠領先于國內。Mhp與其他支原體之間存在嚴重的交叉反應，從而給Mhp的鑒別診斷帶來了困難。目前，關于Mhp診斷方法，國內報道甚少，而國外研究較多。常用的ELISA方法，但由于交叉反應等影響，未能達到理想的效果。通過研究Mhp中特異性蛋白而建立診斷方法是目前研究的焦點。由于Mhp缺乏細胞壁，所以菌體的主要抗原物質存在于莢膜和細胞膜。莢膜中含有多種粘附蛋白和粘附相關蛋白等膜分子；細胞膜成分的2/3為蛋白質，分布于細胞膜的內外層，1/3為脂類，分布于細胞膜的中層。豬肺炎支原體的抗原組成成分主要是蛋白質與脂質兩類。脂質包括糖脂和脂多糖，它們都是半抗原，與蛋白質結合后具有抗原性。

國內外學者已對豬肺炎支原體多種抗原蛋白進行了研究，其中包括乳糖脫氫酶P36蛋白、膜蛋白P46、熱休克蛋白DnaK以及黏附素蛋白P97。這些蛋白均特異性好，且分別是豬肺炎支原體感染早中晚期誘導產生抗體的蛋白之一，是已知抗原蛋白中用于檢測用抗原較為理想的蛋白。體外表達蛋白經鎳柱親合層析純化后作為抗原，建立間接ELISA檢測方法，并優化ELISA的反應條件形成檢測試劑盒，該試劑盒具有高特異性，高穩定性。試劑盒主要供實驗室研究和臨床診斷使用。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種豬肺炎支原體多重組抗原ELISA檢測試劑盒，為實驗室和臨床檢測豬肺炎支原體抗體提供快速、準確、簡便的檢測工具。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種豬肺炎支原體多重組抗原ELISA檢測試劑盒，試劑盒中設有：多重組抗原包被的ELISA板，酶結合物工作液，陽性對照血清，陰性對照血清，樣品稀釋液，二抗稀釋液，10×濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液；其中所述的多重組抗原為豬肺炎支原體蛋白P36、豬肺炎支原體蛋白P46、豬肺炎支原體蛋白P97R1和豬肺炎支原體蛋白DnaK。

其中，本發明所述的豬肺炎支原體蛋白P36、P46、P97R1和DnaK按如下方法獲得：

1、豬肺炎支原體蛋白P36按專利ZL200910027160.4的方法獲得。

2、豬肺炎支原體蛋白P46按文獻【豬肺炎支原體P46基因的克隆及表達，江蘇農業學報，2008,24(3):288-292】的方法獲得。

3、豬肺炎支原體蛋白P97R1按專利ZL200910027159.1的方法獲得。