[發明專利]定量檢測人血清促甲狀腺素受體抗體的酶聯免疫分析試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 201210244006.4
• 申請日: 2012-07-16
• 公開（公告）號: CN102735850A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 李寧;方佩華;陳慧;譚建;柴錦燕
• 申請（專利權）人: 天津醫科大學總醫院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 天津市宗欣專利商標代理有限公司 12103
• 代理人: 董光仁

技術領域

本發明屬于免疫測定法，具體是一種是以多孔酶標板做載體制備固相抗原，用于定量檢測人血清促甲狀腺素受體抗體（TRAb）特別是以甲狀腺刺激阻斷性抗體（TSBAb）為主的酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒及檢測方法。

背景技術

自身免疫性甲狀腺病（autoimmune?thyroid?disease，AITD）是一組發病機制復雜的器官特異性自身免疫疾病，包括Graves病（Graves’?disease，GD）、橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s?thyroiditis，HT）等。人促甲狀腺激素受體(hTSHR)是AITD的主要靶抗原,在AITD的發病中起重要作用。hTSHR是存在人甲狀腺濾泡上皮細胞（TEC）膜上的一種糖蛋白，它與促甲狀腺素（TSH）結合后，調節TEC的生長、分化及其合成和釋放甲狀腺激素的功能。在環境和遺傳因素基礎上，機體免疫功能異常變化導致AITD，hTSHR是AITD的主要自身抗原之一，刺激機體產生促甲狀腺素受體抗體（TRAb），該自身抗體屬于異質性抗體，包括甲狀腺阻斷性抗體（TSBAb）和甲狀腺刺激性抗體（TSAb），前者與TSHR特異位點結合而阻止TSH與TSHR的結合及其生理作用的發揮，導致甲狀腺萎縮和功能下降，表現為甲狀腺功能減退（甲減），多見于HT的后期；后者模擬TSH功能，長期持續地刺激甲狀腺激素合成釋放而導致GD，表現為甲狀腺功能亢進。

TRAb抗原決定簇主要貫穿于hTSHR膜外區(hTSHR-ecd)，是不連續的位點，相互穿插、重疊。TSBAb的抗原決定簇主要集中于hTSHR膜外區羧基端（C端）。

TSBAb與Hashimoto'甲狀腺炎（HT）甲狀腺功能減退關系密切。患者血清中TSBAb與TSHR結合后阻斷細胞內腺苷環化酶系統,通過影響第二信使環-磷酸腺苷（cAMP）的產生而引發自身免疫性甲狀腺疾病的異常甲狀腺功能（甲減）狀態。另外，TSH可以下調Fas在甲狀腺上皮細胞的表達,而TSBAb則通過抑制TSH的作用，增加TEC對Fas介導的凋亡的敏感性，造成HT時甲狀腺組織的破壞及萎縮。TSBAb廣泛存在自身免疫性甲減患者血清中。因此，檢測人血清TSBAb對AITD特別是HT的診斷、療效評價均有重要意義。

此外，研究表明GD患者體內既有TSAb，又有TSBAb，而最后的生物學效應取決于這兩種抗體相對量及其與TSHR的親和力，TSBAb的產生是GD甲亢向甲減自發性轉化的可能因素，它可由TSAb?生物活性轉化而來,或與TSAb?共存于甲減患者血清中。檢測TSBAb對GD治療方案的制定、指導治療有重要的臨床參考價值。

目前，沒有比較滿意的國產TRAb檢測技術。國外引進的相關技術有2種，(1)放射受體法（RRA）?(2)酶免法，均不能區分TSBAb和TSAb，特別是RRA陽性檢出率較低，而價格十分昂貴，至今在國內未能推廣。國外還有一種生物學分析法能區分TSBAb與TSAb，但方法煩瑣，流程長且價格昂貴，只能用于科研，不宜常規使用。

近年又有關于發光生物學分析法的報道，可用于檢測TSBAb。其特點是利用分子生物學技術建立TSHR基因與熒光素酶報告基因共轉染且能穩定表達的中國倉鼠卵巢細胞（CHO），借光產量的測定檢測TSBAb活性。該方法目前是初步研究，技術尚未成熟，還不能用于臨床常規檢測。

發明內容

??本發明就是為了解決目前人血清TRAb特別是TSBAb的檢測陽性檢出率較低，抑或價格十分昂貴問題，而提供一種靈敏度高、特異性好、操作簡便、一次可測定大量樣品的定量人血清TRAb（以TSBAb為主）酶聯免疫檢測試劑盒及檢測方法。

本發明是基于免疫反應和酶促反應，能夠檢測人血清中TRAb（以TSBAb為主）含量，其測定原理是用重組人促甲狀腺素受體膜外區羧基端片段融合蛋白（TrxFus-hTSHRc）做抗原包被96孔酶標板，用含1.0%-5.0%?牛血清白蛋白（BSA）的磷酸鹽漂洗液（PBST）封閉，然后分別加入待測血清樣品和標準液，其中TRAb特別是TSBAb與包被在固相載體上的抗原特異性結合，未結合成分經漂洗去除，再加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗人IgG第二抗體，進行二次抗原抗體反應，經漂洗去除未結合成分后，加顯色底物四甲基聯苯胺（TMB），其在HRP催化下顯色，最后加入終止液終止顯色反應，顯色深淺與樣品中待測物含量成正比，在酶標儀上測定450納米波長處的吸光度值（OD450nm），通過標準曲線計算待測樣品中的TRAb（以TSBAb為主）濃度。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的。