[發(fā)明專利]一種基于微流控芯片的腫瘤細(xì)胞遷移動力學(xué)監(jiān)測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210243148.9
• 申請日: 2012-07-13
• 公開（公告）號: CN102746986A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 秦建華;馬慧朋;許慧;高興華
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12Q1/02
• 代理公司: 沈陽晨創(chuàng)科技專利代理有限責(zé)任公司 21001
• 代理人: 張晨

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及將微流控芯片技術(shù)應(yīng)用到實(shí)時(shí)監(jiān)測的細(xì)胞生物學(xué)研究的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于微流控芯片的腫瘤細(xì)胞遷移動力學(xué)監(jiān)測方法。

背景技術(shù)

細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展至今，主要的培養(yǎng)和研究依賴于是孔板和商品化的transwell小室，集中觀察單一或者多種因素刺激下細(xì)胞形態(tài)變化、生長過程、遷移和增值行為等。而在眾多的細(xì)胞行為研究中，細(xì)胞遷移作為生物體發(fā)育和形態(tài)建成等重要生命過程的基礎(chǔ)，而備受關(guān)注。細(xì)胞遷移一般起始于細(xì)胞對其微環(huán)境刺激的感應(yīng)，微環(huán)境刺激通過細(xì)胞表面受體激活一系列的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與基因轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)而通過細(xì)胞極性的改變、細(xì)胞的粘附及去粘附、細(xì)胞骨架的重排等多個環(huán)節(jié)，最終完成細(xì)胞形態(tài)和位置的改變。對于腫瘤細(xì)胞而言，其遷移過程與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多步驟連續(xù)性很強(qiáng)的主動過程，可分為以下幾個步驟，即局部浸潤、滲入血管、隨血液循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移并在其中存活、腫瘤細(xì)胞外滲移出血管、在新的部位定居并增殖。腫瘤細(xì)胞遷移涉及到腫瘤細(xì)胞從二維的血管微環(huán)境進(jìn)入周圍三維微組織的過程，也是腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生過程決速步的過程。孔板或者transwell小室很難在體外構(gòu)建二維平面到三維空間的界面轉(zhuǎn)換，所以想模擬和重現(xiàn)上述腫瘤細(xì)胞遷移過程是比較困難的。

微流控芯片技術(shù)作為一門迅速發(fā)展起來的科學(xué)技術(shù)，已經(jīng)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)了其獨(dú)特的優(yōu)勢，更因其同細(xì)胞尺寸匹配、環(huán)境同生理環(huán)境相近、在時(shí)間和空間維度上能夠提供更為精確的操控，易于通過靈活設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞功能研究等特點(diǎn)而成為新一代細(xì)胞研究的重要平臺。它對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠?qū)崟r(shí)追蹤，不僅能夠獲得最終結(jié)果，也可以得到細(xì)胞遷移過程中出現(xiàn)的暫時(shí)性信息，為腫瘤細(xì)胞遷移過程提供常規(guī)分析中有可能缺失的重要生物學(xué)信息。而目前，利用微流控芯片進(jìn)行腫瘤細(xì)胞遷移動力學(xué)過程監(jiān)測，尤其是腫瘤細(xì)胞從二維平面遷移運(yùn)動到三維基質(zhì)過程的研究分析還處于空白階段。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種基于微流控芯片的腫瘤細(xì)胞遷移動力學(xué)監(jiān)測方法，特別針對腫瘤細(xì)胞從二維平面遷移運(yùn)動到三維基質(zhì)中的過程，該方法具有對細(xì)胞運(yùn)動實(shí)時(shí)追蹤的特點(diǎn)，同時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)對細(xì)胞運(yùn)動之初的準(zhǔn)確定位。

本發(fā)明提供了一種微流控芯片，該微流控芯片主要由細(xì)胞入口池（1），膠原入口池（2），廢液池（3），細(xì)胞培養(yǎng)室（4），細(xì)胞遷移室（5）組成；細(xì)胞培養(yǎng)室（5）上連細(xì)胞入口池（1），細(xì)胞培養(yǎng)室（5）下連廢液池（3），一個細(xì)胞培養(yǎng)室橫向與三個細(xì)胞遷移室相連。

本發(fā)明提供的微流控芯片，所述微流控芯片由上下兩層不可逆封接而成，上層材料為可透光透氣的PDMS聚合物，下層材料為濃硫酸煮過的潔凈玻璃。

本發(fā)明提供的微流控芯片，所述微流控芯片的上下兩層分別進(jìn)行紫外過夜照射的滅菌處理，然后等離子體處理30-45s進(jìn)行封接。

本發(fā)明提供的微流控芯片，所述微流控芯片是由高度不同的兩部分組成（1）、（3）、（4）高度約為（2）和（5）高度的三倍；其中，（1）、（3）、（4）高度為210μm，（2）和（5）高度為70μm。

本發(fā)明還提供了一種基于所述的微流控芯片的腫瘤細(xì)胞遷移動力學(xué)監(jiān)測方法，方法過程如下：

（1）芯片膠原灌注

用移液器將配制好的膠原工作液加入膠原入口池，每孔0.4μL；加1mLPBS緩沖液于培養(yǎng)皿中，將固定芯片的培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中孵育30min，促使膠原由粘稠狀液體變?yōu)楣麅鰻钅z，凝膠過程結(jié)束后，從細(xì)胞入口池、膠原入口池分別順序加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液；

（2）芯片細(xì)胞接種及培養(yǎng)

細(xì)胞消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁶/mL，取10μL細(xì)胞懸液加入細(xì)胞入口池，并迅速從廢液池吸走0.5μL細(xì)胞培養(yǎng)液，促使細(xì)胞在重力流的作用下快速、均勻地進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室；當(dāng)在光學(xué)顯微鏡下觀察到已經(jīng)有部分細(xì)胞流入廢液池，而細(xì)胞培養(yǎng)室中的細(xì)胞也均勻分布時(shí)，立即將芯片豎立，并移入37℃培養(yǎng)箱中放置。豎立方向?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)室朝上，而細(xì)胞遷移室朝下；豎立放置10min后，取出觀察，如果細(xì)胞緊貼在細(xì)胞培養(yǎng)室與遷移室的交匯處，說明細(xì)胞接種比較成功；將芯片放平移入37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)、每隔24h換液一次，并拍照記錄腫瘤細(xì)胞所在位置；

(3)芯片細(xì)胞遷移實(shí)時(shí)監(jiān)測